玫瑰花 玫瑰茄 枸杞子復合發酵液化學成分的HPLC-HRMS分析△

王喻淇，梅曉丹，李潔，劉子菡，馬濤，林峰，*，張加余

1.濱州醫學院 藥學院，山東 煙臺 260040；2.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；3.江蘇菌鑰生命科技發展有限公司，江蘇 鹽城 100176

許多藥用植物富含黃酮、多糖、皂苷和有機酸等多種有效成分。現代研究也已證明，這些有效成分具有提高免疫力、抗疲勞、抗衰老等調節人體機體平衡的功效[1-3]。傳統中藥憑借其豐富的藥效成分、廣泛的藥用資源和源遠流長的“藥食同源”文化，在為中藥類產品研發提供基礎的同時也已成為藥物開發的化學資源庫。已有研究表明，利用微生物發酵轉化的方法可以增加中藥活性成分的含量，提高化合物結構多樣性，有利于有效成分轉化成活性更好的物質，從而發揮更強的藥理作用[4-5]。因此，通過微生物發酵傳統中藥已成為當前的研究熱點。

玫瑰花RosarugosaThunb.又稱刺玫花、穿心玫瑰等，屬于薔薇科植物。而重瓣紅玫瑰是一種在中國被廣泛食用的玫瑰，花瓣香甜、極具芬芳，被譽為“中國傳統玫瑰的代表”，其具有行氣解郁、疏肝理氣、活血散瘀等多種功效[6-7]。玫瑰茄HibiscussabdariffaL.又名洛神花、紅果梅以及紅角葵等，為錦葵科1年生草本植物，素有“植物紅寶石”的美譽，富含大量的有機酸，例如木槿酸、檸檬酸和原兒茶酸等。其中，木槿酸作為玫瑰茄花萼中所含的1種特殊物質，對心臟病、高血壓、動脈硬化等有很好的療效[8-9]。枸杞子LyciumbarbarumL.又稱枸杞紅實，屬于茄科植物，是我國傳統的補益類名貴中藥。枸杞子除了含有脂肪、蛋白質、維生素和礦物質等營養素外，還含有枸杞多糖、牛磺酸和甜菜堿等有效成分，具有滋補肝腎、益精明目、潤肺止咳和延緩衰老等功效[10-11]。

由于玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子資源豐富，風味獨特，且均具有“藥食兩用”功能，常被制成風味飲品供人們日常飲用。目前，市場上已出現以3者為原料的復合發酵飲品，然而其化學物質基礎尚不明確。因此，本研究以玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子為發酵底物，腸膜明串株菌腸膜亞種為發酵菌種，采用液態發酵技術將3者有機結合制成復合發酵液，并應用高效液相色譜-現行離子阱-靜電場軌道阱質譜(HPLC-LTQ-Orbitrap MS)分析鑒定復合物提取液及發酵液中的化學成分，從而為玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子的深度開發利用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀與LTQ-Orbitrap XL質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站(美國Thermo Scientific公司)；R200D型電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)；KQ-250 DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BXM-30R 高壓蒸汽滅菌鍋(西安儀創實驗室儀器設備有限公司)。

1.2 試藥

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子藥材購自亳州市華云中藥飲片有限公司，經北京中醫藥大學張媛副教授鑒定為正品。質譜級甲醇、乙腈和甲酸購自美國Fisher公司，超純水由Millipore Synergy UV型超純水機制備。沒食子酸、阿魏酸、槲皮素、原兒茶酸、蘆丁和矢車菊-3-O-桑布糖苷等6種對照品購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均不低于98%。

2 方法

2.1 溶液配制

混合對照品溶液的制備：分別取上述6種對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成質量濃度約為100 μg·mL-1的儲備液，用時稀釋成濃度適宜的混合對照品溶液。

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子復合提取液的制備：取枸杞子10 g，加入200 mL純凈水浸泡30 min后，采用榨汁機進行均勻打漿，得到枸杞勻漿；取玫瑰花粉末40 g、玫瑰茄粉末20 g，精密稱定，加入300 mL水，得到混合勻漿；將兩者混合后攪拌均勻；加入K2HPO4調節pH至4.5～5.0；然后向混合液中添加2 g纖維素酶、2 g果膠酶，50 ℃下酶解90 min；加入NaHCO3等調節pH至5.8～6.0后加入20 g蛋白胨、80 g白砂糖，加入純水定容至1000 mL。溶液在90 ℃條件下高壓滅菌30 min后，以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子復合發酵液的制備：復合提取液制備方法同上，待溫度降至室溫，接種腸膜明串株菌腸膜亞種發酵(培養溫度25 ℃，發酵20 d)。取發酵后溶液過濾，濾液以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得復合發酵液。

2.2 實驗條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～10 min，5%B；10～16 min，5%～14%B；16～66 min，14%～51%B；66～70 min，51%～55%B；70%～75 min，55%～90%B)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 質譜條件 ESI離子源，負離子檢測模式；流動相經柱分流后進入質譜檢測器的流速為0.3 mL·min-1；毛細管溫度350 ℃；鞘氣流速9 L·min-1；輔助氣流速3 L·min-1；噴霧電壓3.0 kV；毛細管電壓-35 V；管透鏡電壓-110 V；源內碰撞誘導裂解池碰撞能量(CID)35%。樣品采用高分辨全掃描(FT)，1級掃描分辨率為30 000，質量掃描范圍m/z50～1200，隔離寬度2 Da；二級質譜采用數據依賴性掃描，選取上一級豐度最高的2個峰進行CID碎片離子掃描，激活能量單位0.25 q，激活時間30 ms。

2.3 數據處理

利用Xcalibur 2.1工作站進行數據處理，采用分子式預測模塊預測所有母離子的分子式，相關參數設定為C[0～35]、H[0～50]、O[0～30]、環不飽和雙鍵數(RDB equivalent value)[0～15]，質量精度誤差在±5×10-6以內。

3 結果與討論

本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS對玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復合物提取液發酵前后的化學成分進行分析鑒定。根據所獲得的精確分子量，同時結合相應的色譜保留行為、質譜裂解規律、特征碎片離子、對照品比對以及相關文獻報道，最終鑒定了48個化學成分，其中有6個化學成分可被準確鑒定，結果見圖1。

圖1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS分析玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復合提取液發酵前后總離子流圖

3.1 有機酸類成分的鑒定

有機酸類化合物均含羧基，在質譜裂解過程中易發生脫水和脫羰基反應。本研究從復合發酵液中鑒定的有機酸類化合物主要為綠原酸和小分子酚酸類。該類化合物是玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子所共有的，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集等藥理作用，對心血管疾病防治具有重要的臨床價值[13]。本研究從復合物提取液中共鑒定出30個有機酸類化合物；從復合物發酵液中鑒定了35個有機酸類成分，結果見表1。

根據所獲得的高分辨質譜數據，在保留時間2.63 min下，C1準分子離子峰[M-H]-為m/z207.014 53，計算其精確分子式為C6H8O8，相對分子質量為208.022 46 Da。在負離子模式下，二級碎片離子m/z189是由準分子離子峰脫去1分子水(18 Da)產生的。m/z189進一步丟失1分子CO2產生m/z127的二級碎片離子，故推測C1為木槿酸。

在保留時間4.77 min下，C2的準分子離子峰[M-H]-為m/z191.019 55，計算其精確分子式為C6H8O7，相對分子質量為192.027 55 Da。在負離子模式下，二級碎片離子m/z173是由準分子離子脫掉1分子水產生。m/z173繼續丟掉1分子CO2生成m/z129碎片離子，繼而再又丟失1分子水生成m/z111碎片離子，故可將C2鑒定為檸檬酸。

化合物 C3、C5、C6、C9、C10、C13和C14的準分子離子峰[M-H]-為m/z169.013 14，計算其精確分子式為C7H5O5，誤差均小于5×10-6。經碰撞誘導裂解，m/z169丟失44 Da 產生m/z125[M-H-CO2]-的ESI-MS2基峰離子。結合對照品比對結果，可將C3準確鑒定為沒食子酸，將其他6個化合物鑒定為沒食子酸的同分異構體。

根據所獲得的高分辨質譜數據，C4的準分子離子峰[M-H]-為m/z125.024 50，推斷其精確分子式為C6H5O3，誤差為4.43×10-6。其ESI-MS2譜產生特征離子m/z107[M-H-H2O]-和m/z97[M-H-CO]-，因此推測C4為5-羥甲基糠醛。

在保留時間11.34、23.95、32.76、38.76 min下，C7、C16、C25和C32均產生負離子模式準分子離子峰[M-H]-為m/z191.055 01(C7H12O6，誤差≤ 5×10-6)。二級碎片離子m/z173由準分子離子m/z191脫掉1分子水產生；m/z173繼續丟掉1分子水和1分子CO生成碎片離子m/z127，因此可將化合物 C7、C16、C25和C32鑒定為奎寧酸及其同分異構體。

化合物C8和C11準分子離子峰[M-H]-分別為m/z153.019 67和153.019 29，推斷其最可能的分子式為C7H5O4，誤差均小于5×10-6。其產生二級碎片離子m/z109[M-H-CO2]-和125[M-H-CO]-，故將其鑒定為原兒茶酸。并經對照品比對，確定化合物C11為原兒茶酸，并將C8鑒定為原兒茶酸的同分異構體。

在負離子模式下，化合物C12、C21和C30的準分子離子峰為m/z163.038 97[M-H]-。根據元素組成分析，推斷它們的化合物分子式為C9H7O3。ESI-MS2譜主要的碎片離子有m/z145、135和119。其中，m/z145為母離子失去1分子H2O產生的；m/z135為母離子丟失1分子CO產生的，m/z119則是母離子丟失1分子CO2產生的。結合文獻報道[13]，可推測化合物C12、C21和C30為對香豆酸及其同分異構體。

在保留時間23.83、34.70 min下，化合物C15和C28的準分子離子峰分別為m/z179.035 17和179.035 05(C9H7O4，誤差≤±5×10-6)。通過碰撞誘導，m/z179產生了特征性碎片離子m/z135[M-H-CO2]-和m/z107[M-H-CO2-CO]-。因此，可推測化合物C15和C28為咖啡酸及其同分異構體。

根據所獲得的高分辨質譜精確相對分子質量以及多級質譜碎片離子信息，推斷化合物C17、C24和C29為單咖啡酰奎寧酸類化合物。它們的準分子離子峰[M-H]-為m/z353.086 70，誤差均小于5×10-6，推斷其最可能的分子式為 C16H17O9。單咖啡酰奎寧酸類化合物的ESI-MS2譜中多產生m/z191[quinic acid-H]-、179[caffiec acid-H]-和173[quinic acid-H-H2O]-等特征碎片離子。當咖啡酰基在奎寧酸母核上為4-位取代時，ESI-MS2譜的基峰離子為m/z173，因此化合物C29為隱綠原酸。當咖啡酰基在奎寧酸母核上為3-位和5-位取代時，它們的基峰離子均為m/z191，其中3-位取代時m/z179的豐度約為40%，5-位取代時m/z179的豐度約為 5%，與之前的文獻報道一致[14]，由此可鑒定化合物C17為新綠原酸，化合物C24是綠原酸。

在負離子模式下，誤差在±5×10-6范圍內，化合物 C18、C19、C23和C27準分子離子[M-H]-均為m/z515.139 53，所有的元素組成為C22H27O14。根據所獲得的高分辨質譜數據，化合物經碰撞誘導裂解后均減少162 Da，分別產生m/z353[M-H-caffeoyl/glu]-、335[M-H-caffeoyl/glu-H2O]-、191[quinic acid-H]-，表明化合物具有1分子葡萄糖基。因此，化合物 C18、C19、C23和C27推斷為單咖啡酰奎寧酸葡萄糖苷。

在保留時間26.88、43.48 min，化合物C20和C37的準分子離子峰[M-H]-分別為m/z197.045 79和m/z197.045 90。根據元素組成分析，可推斷化合物分子式為C9H9O5。m/z197產生了特征性碎片離子m/z182[M-H-CH3]-和m/z157[M-H-CO2]-，表明化合物具有1分子甲氧基。因此，可將化合物C20和C37鑒定為丁香酸。

根據所獲得的高分辨質譜數據，化合物C22、C33和C34的準分子離子峰[M-H]-均為m/z337.091 79，誤差均小于5×10-6，推斷最可能的分子式為C16H17O8。它們的二級質譜主要特征碎片離子為m/z191[quinic acid-H]-、173[quinic acid-H-H2O]-和163[p-coumaric acid-H]-。根據文獻報道[15]，當對香豆酰基的酯化位置在3、4或5位時，所產生的ESI-MS2基峰離子分別為m/z163、m/z173和m/z191，因此分別將C22、C33和C34鑒定為3-對香豆酰奎寧酸、5-對香豆酰奎寧酸和4-對香豆酰奎寧酸。

化合物C26和C31的準分子離子峰[M-H]-均為m/z193.049 53，根據所獲得的高分辨質譜精確相對分子質量以及多級質譜碎片離子信息，推斷最可能的元素組成為C10H9O4，誤差均小于5×10-6。在ESI-MS2譜中，它們的準分子離子峰經碰撞誘導裂解后產生碎片離子m/z178，質量數減少15 Da，即丟失1分子甲基，同時丟失1分子CO2產生m/z149 的碎片離子，而m/z149進一步丟失1分子甲基產生m/z134的碎片離子。結合對照品比對，可確定化合物C26 為阿魏酸，鑒定化合物C31為阿魏酸或其同分異構體。

在保留時間42.38、42.94 min，化合物C35和C36的準分子離子峰分別為m/z367.103 88和m/z367.103 79，推斷最可能的元素組成為C17H19O9，誤差分別為4.14×10-6和3.89×10-6。通過碰撞誘導裂解后，m/z367產生了特征性碎片離子：m/z193[ferulic acid-H]-、191[quinic acid-H]-和173[quinic acid-H-H2O]-，故推斷兩者屬于阿魏酰奎寧酸類成分。前期研究表明[16]，4-阿魏酰奎寧酸的MS2基峰離子為m/z173，5-阿魏酰奎寧酸的MS2基峰離子為m/z191，因此可推測化合物C35為5-阿魏酰奎寧酸，C36為4-阿魏酰奎寧酸。

在負離子模式下，誤差在±5×10-6范圍內，化合物 C38和C39準分子離子[M-H]-均為m/z300.997 89，元素組成為C14H5O8。根據所獲得的高分辨質譜數據，化合物經碰撞誘導裂解后分別產生m/z300[M-2H]-、273[M-H-CO]-和257[M-H-CO2]-。因此可推測化合物C38和C39為鞣花酸或其同分異構體。

表1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 對玫瑰花、玫瑰茄、枸杞復合發酵液發酵前后有機酸成分的鑒定分析

續表1

注：*與對照品比對鑒定；+表示檢出；-表示未檢出；#表示該目標化合物或其同分異構體，下同。

3.2 黃酮類成分的鑒定

復合物中的黃酮類成分主要來自于玫瑰花和玫瑰茄，是以槲皮素或山柰酚為苷元的黃酮苷。黃酮糖苷類化合物的質譜裂解一般為糖苷鍵斷裂，糖完全脫去后產生豐度最大的苷元離子，同時在ESI-MS2譜產生黃酮苷元開環裂解后的一系列碎片離子峰。結果表明，復合物經發酵后黃酮類成分由4種增加為6種，增加的2種均為黃酮苷元，分別是兒茶素和槲皮素，結果見表2。

根據所獲得的高分辨質譜數據，化合物F1的準分子離子峰[M-H]-為m/z289.071 60，推斷其最可能的分子式為C15H13O6，誤差為1.38×10-6。化合物經碰撞誘導裂解后產生碎片離子m/z245[M-H-CO2]-，同時產生m/z203[M-H-C2H2O-CO2]-和m/z179[M-H-C2H2O-C3O2]-等特征碎片離子，結合對照品比對及文獻報道[17]，確定化合物F1為兒茶素。

化合物F2和F4的準分子離子峰[M-H]-均為m/z609.145 01，根據所獲得的高分辨質譜精確相對分子質量以及多級質譜碎片離子信息，推斷最可能的元素組成為C27H29O16，誤差分別為1.91×10-6和1.31×10-6。研究表明，蕓香糖為鼠李糖基(1～6)葡萄糖基連接結構，經誘導裂解后，蕓香糖苷類物質易直接失去蕓香糖殘基(308 Da)，產生[M-H-308]-離子。在化合物F2和F4的ESI-MS2譜中，它們的準分子離子峰經碰撞誘導裂解后產生m/z429[M-H-Glu-H2O]-、301[M-H-Rha-Glu]-、300[M-2H-Rha-Glu]-和255[M-H-Rha-Glu-H2O-CO]-等碎片離子。經對照品及文獻[18]比對，化合物F4裂解途徑與蘆丁相似，其可能裂解途徑見圖2，因此推斷化合物F4為蘆丁，F2為其同分異構體。

在負離子模式下，化合物F5的準分子離子峰為m/z301.035 06，誤差為2.59×10-6，元素組成為C15H9O7。化合物F5經誘導裂解后連續丟失1分子CO2和1分子H2O產生m/z273的基峰離子。結合對照品比對，可將F5準確鑒定為槲皮素。化合物F3的準分子離子峰為m/z463.087 10，推斷其最可能的分子式為C21H19O12，其母離子經裂解后產生碎片離子m/z301，質量數減少162 Da，即丟失1分子葡萄糖殘基。而m/z301離子進一步破裂產生的碎片離子與槲皮素一致，因此鑒定化合物F3為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

在保留時間71.37 min，化合物F6的準分子離子峰[M-H]-為593.129 82，根據元素組成分析，其分子式為C30H25O13。該離子在進一步的質譜裂解過程中丟失了308 Da，產生 ESI-MS2苷元基峰離子m/z285，表明其屬于蕓香糖苷。根據F6苷元離子進一步裂解產生的碎片離子，推斷化合物F6為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

3.3 花青素類成分的鑒定

花青素是一種存在于植物中的水溶性天然色素，安全性高，常用作食品的功能性天然色素，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抑制癡呆癥的發生和預防腦細胞變性等作用[19]。花青素是玫瑰花及玫瑰茄的主要生物活性成分之一，其主要包括飛燕草素和矢車菊素的糖苷。本實驗從復合物提取液中鑒定了3個花青素類成分；從復合物發酵液中鑒定了2個花青素類成分，結果見表3。

在負離子模式下，化合物A1和A2準分子離子峰[M-H]-分別為m/z595.130 31和m/z595.130 55，保留時間分別為50.64、52.6 min，計算其精確分子式為C26H27O16，誤差均小于5×10-6。在其ESI-MS2譜中，m/z595經誘導裂解后產生碎片離子m/z301，質量數減少294 Da，即丟失1分子桑布雙糖(Sam)殘基。同時，還進一步生成了m/z300[M-2H-Sam]-及255[M-H-Sam-H2O-CO]-等碎片離子，由此可將化合物 A1和A2鑒定為飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷。

圖2 蘆丁的裂解途徑(負離子模式)

表2 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 對玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復合發酵液發酵前后黃酮類成分的鑒定分析

表3 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 對玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復合發酵液發酵前后花青素類成分的鑒定分析

同理，化合物A3的準分子離子峰[M-H]-為m/z579.135 93，推斷它最可能的分子式為C26H27O15，誤差為2.56×10-6。在其ESI-MS2譜中，m/z447離子中性丟失1分子桑布雙糖殘基，產生m/z285[M-H-Sam]-、284[M-2H-Sam]-和 223[M-H-Sam-CO2-H2O]-等碎片離子。結合對照品比對，可將A3準確鑒定為矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷。

4 結論

現代中藥發酵研究是中藥領域研究熱點之一。前期研究發現，在發酵的過程中，發酵菌種通過產生多種酶類以及其他初級、次級代謝產物，對中藥進行分解代謝，將許多人體不能直接吸收利用的大分子化合物降解成小分子化合物，并產生新的活性物質和新的功能[20]；或產生破壁酶對中藥細胞進行破壁處理，促進有效物質的溶出，提高了其活性成分的濃度，有利于有效成分在人體的吸收和利用[21-22]。

本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS高分辨液質聯用技術，對玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子復合提取液和發酵液中的48種植物源性化學成分進行了篩選鑒定，其中包括39種有機酸、6種黃酮以及3種花青素類成分。結果表明，復合提取液經發酵后，各類成分種類及含量均發生不同程度的變化，如槲皮素及其糖苷衍生物。前期研究證明，脂溶性的槲皮素在胃部、小腸各段及結腸均可以被有效吸收，繼而發生進一步的代謝轉化[23]；槲皮素糖苷類物質的吸收則需要在體內水解酶(如乳糖根皮苷酶)的作用下去糖基化，釋放出槲皮素再吸收[24]。本研究在玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子復合提取液中僅檢測到槲皮素-3-O-葡萄糖苷；而在發酵液中，既檢測到槲皮素-3-O-葡萄糖苷，也檢測到槲皮素，這可能是苷類成分在發酵菌種腸膜明串株菌腸膜亞種的作用下發生了水解，將糖苷類物質轉化為小分子苷元，更利于有效成分在體內發生廣泛的代謝和轉化。綜上所述，本研究為玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子進一步開發利用提供了新依據，并對現代中藥微生物發酵研究提供參考。