銀杏內(nèi)酯A的BCS分類及吸收機(jī)制研究△

李楠楠，勞元圣，高堯春，李楠，張夢雪，黎迎，劉海波，董政起*

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

銀杏內(nèi)酯是銀杏葉主要成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和M(GKA、GKB、GKC、GKJ、GKM)等[1]，銀杏內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化、改善腦缺血以及神經(jīng)保護(hù)作用[2]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[1]，拮抗血小板活性因子PAF作用[3]等。銀杏內(nèi)酯注射液主要成分有白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C[4]。目前，銀杏內(nèi)酯注射液使用較為廣泛，但有研究表明其存在嚴(yán)重胃絞痛或周身疼痛、過敏等不良反應(yīng)[5]。口服制劑能夠在幫助提高患者適用性的同時(shí)降低不良反應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)擬以銀杏內(nèi)酯A為模型藥物，建立以溶解性和滲透性為指標(biāo)的系統(tǒng)、快速、準(zhǔn)確評價(jià)藥物口服生物利用度的方法，同時(shí)分析目前市面上沒有銀杏內(nèi)酯口服劑型的原因，并為下一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC；電熱恒溫水浴鍋(HHS型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；旋渦振蕩器(VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(INC108型，德國MEMMERT公司)；倒置顯微鏡(GX51型，奧林巴斯公司)；超凈臺(SCB-1220型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；微量振蕩器(MM-1型，金壇市正基儀器有限公司)；全自動跨膜電阻測量儀(德國Nanoanalytics公司)；高壓滅菌罐(DY2009X-032-00，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；酶標(biāo)儀(Spectra max型，美國MD公司)；藥物滲透性檢測儀(PAMPA-Evolution)。

1.2 細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。

1.3 試藥

銀杏內(nèi)酯A(成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-18031502，純度：99.70%)；熒光素鈉(Coolaber公司，批號：518-47-8，純度：98%)；MEM/EBSS(Hyclone Thermo公司，批號：AC1214569)；非必需氨基酸(Gibco公司，批號：1896361)；胰酶(Gibco公司，批號：1933273)；雙抗(Gibco公司，批號：1851595)；胎牛血清(Gibco公司，批號：1856032)；二甲基亞砜(Sigma 公司，批號：SHBG3288V)；Hank′s溶液(Solarbio公司，批號：20180713)；MTT(Amresco公司，批號：298-93-1)；12孔Transwell TM培養(yǎng)板(1.12 cm2，0.4 μm，Corning公司，批號：34717041)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司，批號：15718601)；T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司，批號：35216601)；乙腈(色譜純，德國默克公司，批號：75-05-8)；甲醇(色譜純，德國默克公司，批號：67-56-1)。

2 方法

2.1 樣品的制備

精密稱取銀杏內(nèi)酯A對照品10.4 mg置于0.5 mL EP管中，加入二甲基亞砜(DMSO)配成質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的銀杏內(nèi)酯A對照品溶液。

2.2 銀杏內(nèi)酯A定量檢測

色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；保護(hù)柱(VanGuardTMPre-Column 3/Pk，5 mm×2.1 mm Column)；流動相為水-甲醇(55∶45)；檢測波長為220 nm；流速為0.2 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；檢測器為H-class PDA。

線性關(guān)系考察：精密吸取銀杏內(nèi)酯A對照品溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為200、100、50、20、10、5、2、1 μg·mL-1的溶液，混勻后0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，按2.2中的色譜方法進(jìn)行定量分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得線性回歸方程：Y=26 436X+49 759(r=0.999 7)線性范圍為1～200 μg·mL-1。

精密度與回收率考察：選擇25、50、100 μg·mL-1低、中、高3個質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A樣品，測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度RSD 1.08%<2%。每天使用新配制的25、50、100 μg·mL-1低、中、高3個質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A樣品，連續(xù)3 d，計(jì)算日間精密度RSD為1.03%<2%。說明該分析方法的精密度符合方法學(xué)要求。按精密度實(shí)驗(yàn)操作，計(jì)算求得實(shí)測質(zhì)量濃度，與理論質(zhì)量濃度比較得到方法的回收率為98.6%，RSD為1.12%<2%，說明該分析方法的回收率符合方法學(xué)要求。

2.3 軟件預(yù)測

實(shí)驗(yàn)采用MOE、Discovery Studio、StarDrop 3種軟件對銀杏內(nèi)酯A進(jìn)行預(yù)測，分別得出溶解性(lgS、lgP、lgD、ADMET_Solubility_Level)、滲透性(HIA category、ADMET_Absorption_Level)及P-gp底物判斷等相關(guān)參數(shù)對銀杏內(nèi)酯A生物藥劑學(xué)屬性進(jìn)行預(yù)測。

2.4 銀杏內(nèi)酯A溶解性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)工業(yè)指導(dǎo)原則[6]：稱取銀杏內(nèi)酯A溶于水(pH 5.8)、pH 1.2、4.0、6.8緩沖液中，使藥物達(dá)到飽和狀態(tài)，置于37 ℃搖床振蕩3 h，30 000 r·min-1離心25 min(離心半徑：5 cm)，取上清液10 μL，適當(dāng)稀釋后，按2.2色譜條件檢測藥物濃度，重復(fù)3次，計(jì)算溶解度及D0值。

D0=(M0/V0)/Cs

(1)

式中：M0為人的最大給藥劑量(mg)，V0為250 mL，Cs為溶解度(mg·mL-1)。

本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)動物與人之間的等效劑量換算方法[7]來計(jì)算銀杏內(nèi)酯A的M0，根據(jù)文獻(xiàn)[8]中兔的最大給藥量劑量為10.64 mg，因此可得人的最大給藥劑量為89.04 mg。

《中華人民共和國藥典》(2015版)的溶解性測定方法[9]：精密稱取藥物10 mg置于具塞離心管中，加入5 mL蒸餾水，樣品試管置于37 ℃水浴，每5 min振蕩30 s，觀察30 min內(nèi)的溶解情況，充分混勻后取出部分溶，并用HPLC分析銀杏內(nèi)酯A的含量。

2.5 銀杏內(nèi)酯A的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

每孔1×105個/mL的Caco-2細(xì)胞懸液接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。其中2組為空白組和陰性對照組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去廢液并向其中加入用不完全培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A溶液，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1MTT溶液(MTT采用PBS配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄廢液，然后向其中加入150 μL的DMSO溶液，置于搖床低速振蕩10 min，將其放于酶標(biāo)儀中檢測各孔在570 nm處的吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞抑制率，本實(shí)驗(yàn)選取抑制率低于10%的高、中、低3個質(zhì)量濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞抑制率=[(A陰性對照組-A空白組)-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)]/(A陰性對照組-A空白組)×100%

(2)

2.6 銀杏內(nèi)酯A滲透性實(shí)驗(yàn)

2.6.1 Caco-2細(xì)胞模型的建立及轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 首先用含1%非必需氨基酸、1%雙抗、10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇Caco-2細(xì)胞，然后將其置于37 ℃、5%CO2、90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)3～5 d，長至80%～90%程度，進(jìn)行傳代。在細(xì)胞傳3～4代將其凍存保存在液氮中，便于下次使用。

取40～60代長至80%～90%的Caco-2細(xì)胞每孔2×105個/mL的細(xì)胞懸液接種在12孔Traswell細(xì)胞培養(yǎng)板上，頂端(AP)側(cè)加0.5 mL的細(xì)胞液，底端(BL)側(cè)加1.5 mL的細(xì)胞液，隔天換液，培養(yǎng)至19～21 d，并且隔天使用全自動跨膜電阻測量儀測試細(xì)胞TEER值。

21 d時(shí)，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，首先吸出兩側(cè)培養(yǎng)液，加入Hank′s溶液清洗1遍，然后再加Hank′s溶液在培養(yǎng)箱中孵育20 min，取出檢測其TEER值>500 Ω進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在AP側(cè)加入不同濃度的藥物溶液，BL側(cè)加入空白Hank′s溶液，在15、30、60、90、120、150、180 min的不同時(shí)間段在BL側(cè)取200 μL的樣品，同時(shí)在相同的位置補(bǔ)充200 μL空白Hank′s溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再次測試細(xì)胞TEER值。將樣品前處理后按照2.2的色譜條件在超高效液相色譜(UPLC)中進(jìn)行含量測定，計(jì)算其表觀滲透系數(shù)(Papp)。

Papp=(dQ/dt)/(A×C0)

(3)

其中，dQ/dt(μg·s-1)為藥物單位時(shí)間轉(zhuǎn)運(yùn)量，C0(mg·L-1)為藥物在供給室的初始質(zhì)量濃度，A(1.12 cm2)為轉(zhuǎn)運(yùn)膜面積。

2.6.2 吸收機(jī)制研究 在建立好的Caco-2細(xì)胞模型中取高、中、低3個質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A溶液和含有維拉帕米的銀杏內(nèi)酯A溶液進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，在AP側(cè)加入0.5 mL的藥物溶液，同時(shí)在BL側(cè)加入1.5 mL的空白Hank′s溶液作為接收液，在15、30、60、90、120、150、180 min的不同時(shí)間段在BL側(cè)取200 μL的樣品，同時(shí)在相同的位置補(bǔ)充200 μL空白Hank′s溶液。另外，在BL側(cè)加入1.5 mL的藥物溶液，同時(shí)在AP側(cè)加入0.5 mL的空白Hank′s溶液作為接收液，在15、30、60、90、120、150、180 min的不同時(shí)間段在BL側(cè)取200 μL的樣品，同時(shí)在相同的位置補(bǔ)充200 μL空白Hank′s溶液。將所取樣品與UPLC進(jìn)行含量測定，分析藥物在AP→BL與BL→AP的不同轉(zhuǎn)運(yùn)中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)與藥物濃度及時(shí)間的關(guān)系以及藥物是否是P-gp底物。

2.6.3 PAMPA模型的建立及轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 模型建立：取配制好的磷脂溶液加在平行人工膜滲透性(PAMPA)模型的疏水網(wǎng)膜表面上，供室馬上加入200 μL含藥物的Hank′s溶液，受室加入200 μL Hank′s溶液，整個加藥過程在10 min內(nèi)完成。間隔30 min在供室取100 μL溶液，按2.2的色譜條件進(jìn)行含量測定，計(jì)算其有效滲透率(Pe)。

Pe=-ln[1-(CA(t)/Cequilibrium]/A×(1/VD+1/VA)×t

(4)

Cequilibrium=[CD(t)×VD+CA(t)×VA]/(VD+VA)

(5)

其中，A表示人工磷脂膜面積(0.32 cm2)，VD表示供體側(cè)的體積(mL)，VA表示受體側(cè)的體積(mL)，t表示滲透時(shí)間(min)，CA(t)表示在t時(shí)間內(nèi)受體液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，CD(t)表示t時(shí)間內(nèi)供體液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 軟件預(yù)測的結(jié)果

在軟件MOE預(yù)測結(jié)果中，lgP為0.259 7，h_lgS為-2.865，lgS為-3.26，根據(jù)FDA中的高溶解度大于或等于85%的藥物，在軟件中高溶解度藥物的lgS的范圍在-1～5，可以表明銀杏內(nèi)酯A為難溶性藥物；在軟件Discovery Studio預(yù)測結(jié)果中，在軟件中可以根據(jù)ADMET_Solubility_Level對藥物的水溶性高低進(jìn)行判斷，預(yù)測結(jié)果顯示ADMET_Solubility_Level為3，ADMET_Absorption_Level為3，lgD為-0.921，ADMET_Solubility_Level>0的范圍內(nèi)表明藥物的水溶性過高表明銀杏內(nèi)酯A水溶性好，ADMET_Absorption_Level為3時(shí)表明化合物在腸道內(nèi)的吸收情況差；在StarDrop軟件預(yù)測結(jié)果中，lgS為2.013，HIA category為“+”， P-gp category為“no”， 其中HIA表示腸道吸收，為“+”時(shí)，代表藥物吸收>30%，因此預(yù)測銀杏內(nèi)酯A的結(jié)果為溶解性為微溶，藥物吸收>30%，不受P-gp調(diào)控。其中軟件MOE預(yù)測的溶解度結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致。

3.2 溶解性結(jié)果

根據(jù)美國FDA的檢測方法，銀杏內(nèi)酯A在pH 1.2、4.0、6.8及水中的D0值分別為25.38、26.66、66.46、59.46，可以得出其D0值均大于1，因此可以判斷其為低溶解性藥物。根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015版)的溶解性測定方法[9]：銀杏內(nèi)酯A在水中溶解度為0.006 g·mL-1，小于極微溶的標(biāo)準(zhǔn)0.01 g·mL-1，因此銀杏內(nèi)酯A為極微溶。

3.3 銀杏內(nèi)酯A的細(xì)胞毒性

采用MTT法檢測不同濃度的銀杏內(nèi)酯A對Caco-2細(xì)胞存活率的影響，見圖1。

注：與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 MTT法檢測不同濃度銀杏內(nèi)酯A的Caco-2細(xì)胞存活率

因此實(shí)驗(yàn)取細(xì)胞存活率>90%的高、中、低3個質(zhì)量濃度為300、400、500 μg·mL-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.4 藥物滲透性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 滲透性判斷 實(shí)驗(yàn)主要以Papp為14.96×10-6cm·s-1為臨界值[10]對銀杏內(nèi)酯A的滲透性高低進(jìn)行判斷，AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中銀杏內(nèi)酯A的Papp為8.04×10-6～13.99×10-6cm·s-1，小于該值，因此判斷銀杏內(nèi)酯A屬于低滲透性藥物。

3.4.2 吸收機(jī)制 根據(jù)圖2～4，可得出銀杏內(nèi)酯A在AP→BL與BL→AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量伴隨著時(shí)間逐步增加且在3 h內(nèi)沒有飽和，說明對時(shí)間具有一定的依賴性，在30 min中后不同濃度組的趨勢不同，其中高濃度組較中濃度組在同一時(shí)間段內(nèi)它的轉(zhuǎn)運(yùn)量在AP→BL與BL→AP側(cè)明顯增加，推測銀杏內(nèi)酯A以被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主。由于BL→AP側(cè)高、中、低濃度組在不同的時(shí)間點(diǎn)它們的轉(zhuǎn)運(yùn)量差異不大，通過對高、低2個濃度組在AP→BL側(cè)的比較，可以得出它們的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)Papp：低濃度>高濃度，隨著給藥濃度的增加，轉(zhuǎn)運(yùn)速率反而減小，因此推測轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能存在主動轉(zhuǎn)運(yùn)的參與，從而導(dǎo)致Papp計(jì)算公式中的分子部分增加幅度減小，而高濃度時(shí)分母C0較大，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)速率在低濃度時(shí)較高。高、中、低3個濃度的外排系數(shù)(ER)分別為1.11、1.27、0.85，均小于1.5，說明銀杏內(nèi)酯A以被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主。且雙側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp均小于14.96×10-6cm·s-1，說明銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。

圖2 銀杏內(nèi)酯A的AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間和濃度的變化

圖3 銀杏內(nèi)酯A的BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間和濃度的變化

注：n=3，*P<0.05。圖4 銀杏內(nèi)酯A的Papp在不同濃度不同方向的變化

P-gp是可以將藥物從AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到BL側(cè)的一種外排蛋白，主要存在于腸道細(xì)胞中[10]。根據(jù)圖5可以得出，銀杏內(nèi)酯A與含有同等濃度的維拉帕米相比較，它們的Papp差異不大，且P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明添加P-gp抑制劑維拉帕米后，對實(shí)驗(yàn)組的銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運(yùn)速率無影響，說明銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運(yùn)不受P-gp的調(diào)控，銀杏內(nèi)酯A不是P-gp的底物。

注：n=3，P>0.05。圖5 維拉帕米對銀杏內(nèi)酯A轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

3.4.3 PAMPA膜的滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熒光素鈉試漏：樣品取樣結(jié)束后，吸出供體液，向其中加入2 mg·mL-1的熒光素鈉溶液，在酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測。根據(jù)圖6樣品與空白Hank′s溶液的A值無明顯差異，說明無藥物滲透，膜完整性良好。

圖6 熒光素鈉A值與空白Hank′s溶液的A值比較

根據(jù)圖7～8可得出銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運(yùn)量是隨著時(shí)間的增加而增加，并且在3 h之內(nèi)未出現(xiàn)飽和狀態(tài)，說明具有一定的時(shí)間依賴性。比較高、中、低3組濃度的Pe差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以判斷其為被動轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)吸收良好的藥物的Pe>10-6cm·s-1；吸收為1%～100%的藥物的Pe為0.1×10-6～1×10-6cm·s-1；而吸收差的藥物(即吸收<1%)的Pe<10-6cm·s-1，銀杏內(nèi)酯A的Pe均小于1×10-6cm·s-1，說明銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。

圖7 銀杏內(nèi)酯A轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間和濃度的變化

注：n=3，**P<0.01。圖8 銀杏內(nèi)酯A的Pe在不同濃度的變化

4 結(jié)論

D0值和水中溶解度結(jié)果證明銀杏內(nèi)酯A為難溶性藥物，Caco-2細(xì)胞及PAMPA膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。根據(jù)Amidon等[11]于1995年提出的生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)理論，綜合判定，銀杏內(nèi)酯A為BCSⅣ類藥物，溶解性和滲透性差是導(dǎo)致其口服生物利用度低的重要因素。此外，銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運(yùn)不受P-gp的調(diào)控，吸收機(jī)制以被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主。MOE軟件在預(yù)測銀杏內(nèi)酯A溶解性時(shí)，結(jié)果更為準(zhǔn)確；StarDrop軟件在預(yù)測銀杏內(nèi)酯A與P-gp相關(guān)性上也得出較為準(zhǔn)確的結(jié)論。

5 討論

實(shí)驗(yàn)從藥物的溶解度和滲透性兩方面展開。溶解度方面，根據(jù)美國FDA指導(dǎo)原則，計(jì)算其D0值，均大于1表明銀杏內(nèi)酯A為低溶解性藥物；根據(jù)《中華人民共和國藥典》的溶解度劃分，銀杏內(nèi)酯A為難溶性藥物。軟件MOE、Discovery Studio、StarDrop在預(yù)測銀杏內(nèi)酯A的溶解性時(shí)，結(jié)果分別為難溶、易溶、微溶，相差較大，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相符，一方面可能因?yàn)橛械能浖m合預(yù)測大分子化合物，另一方面可能是軟件預(yù)測主要考慮其化學(xué)結(jié)構(gòu)并沒有實(shí)際考慮到化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基在不同pH條件下發(fā)生反應(yīng)，改變原有結(jié)構(gòu)。軟件預(yù)測可以高效簡便的判斷出藥物的性質(zhì)，但是可能與實(shí)際有所出入，軟件預(yù)測僅可以作為判斷的一個指標(biāo)，不能作為判斷的主要依據(jù)。

在滲透性方面，本實(shí)驗(yàn)主要采用Caco-2單層細(xì)胞模型和PAMPA模型。在Caco-2單層細(xì)胞模型中，AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中銀杏內(nèi)酯A的Papp為8.04×10-6～13.99×10-6cm·s-1，在BL→AP轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中銀杏內(nèi)酯A的Papp為11.79×10-6～12.95×10-6cm·s-1，Volpe等[12]通過對Caco-2細(xì)胞單層模型的實(shí)驗(yàn)，以23個模型藥物為標(biāo)準(zhǔn)，研究其Papp與其通過人體小腸吸收fa值比較，驗(yàn)證了BCS評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，因此建立以Caco-2細(xì)胞模型培養(yǎng)21 d時(shí)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)滲透性高低評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，臨界Papp為14.96×10-6cm·s-1。同時(shí)相關(guān)文獻(xiàn)也有以Papp<1.0×10-6cm·s-1為吸收性差，Papp在1.0×10-6～10×10-6cm·s-1為吸收中等，Papp>10×10-6cm·s-1為吸收性好。本實(shí)驗(yàn)主要以Papp為14.96×10-6cm·s-1為臨界值，銀杏內(nèi)酯A屬于低滲透性藥物，但是以另一個標(biāo)準(zhǔn)銀杏內(nèi)酯A屬于高滲透性藥物。在PAMPA模型中，其Papp為2.45×10-6～3.42×10-6cm·s-1，因此銀杏內(nèi)酯A屬于低滲透性藥物。綜合結(jié)果判斷銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。通過細(xì)胞模型可以判斷其為被動轉(zhuǎn)運(yùn)，因此Caco-2單層細(xì)胞模型應(yīng)用更為廣泛，各種規(guī)定更加完善，PAMPA模型操作更為簡單快捷，且耗時(shí)短，但由于所用的磷脂膜沒有蛋白的存在，更適合用于被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主的藥物。

實(shí)驗(yàn)以銀杏內(nèi)酯中的主要成分之一的銀杏內(nèi)酯A為模型藥物進(jìn)行研究，結(jié)果表明其滲透性較差，在其他劑型上應(yīng)用具有一定的局限性。銀杏內(nèi)酯A結(jié)構(gòu)中存在羥基可能是影響其滲透性的原因，有研究表明對羥基進(jìn)行甲基化修飾可以提高具有羥基取代化合物的滲透性[13]；透膜過程中氫鍵能力越強(qiáng)，滯留時(shí)間就越長也是滲透性低的原因之一[14]，可以減輕氫鍵能力增加其滲透性。難溶性藥物制備成固體分散體、納米制劑等，均是提高其溶解度的有效方法[15]。

實(shí)驗(yàn)通過軟件預(yù)測、美國FDA指導(dǎo)原則、《中華人民共和國藥典》的溶解度方法、Caco-2單層細(xì)胞模型和PAMPA模型系統(tǒng)的對銀杏內(nèi)酯A的滲透性研究進(jìn)行其BCS分類找出其生物利用度低的主要原因，為快速評價(jià)藥物基于生物藥劑學(xué)屬性的成藥性，進(jìn)而針對性地提高生物利用度的研究提供支撐。