HPLC波長切換法同時測定舒爾經膠囊中7種指標性成分的含量

黃硯，楊俊卿

1.電子科技大學醫學院 附屬婦女兒童醫院/成都市婦女兒童中心醫院 國家藥物臨床試驗機構，四川 成都 611731；2.重慶醫科大學 藥學院，重慶 400016

舒爾經膠囊由香附、白芍、赤芍、延胡索、柴胡、當歸、牡丹皮等11味中藥加工而成，具有疏肝活血、調經止痛的功效，臨床上主要用于痛經、月經失調屬氣滯血瘀證的治療[1]，現代研究表明，舒爾經制劑可以提高去卵巢大鼠血清中雌二醇和孕酮的含量，改善血液流變性，明顯增加子宮系數，改善子宮和陰道的病理學變化，降低大鼠正常子宮活動的頻率，顯著抑制縮宮素引起子宮平滑肌收縮的頻率及收縮強度[2]，對大鼠子宮肌瘤具有一定的抑制作用，對痛經有較強的鎮痛作用[3]；舒爾經制劑對原發性痛經[4]、經前期綜合征[5]、氣滯血瘀型痛經[6-7]等疾病臨床效果顯著，且不良反應少。舒爾經膠囊現行質量標準為國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS-10704(ZD-0704)-2002-2012Z，標準僅對方中延胡索所含延胡索乙素進行定量研究，中成藥復方制劑由多味中藥加工而成，每味中藥含有多種活性成分，單一成分難以全面評價舒爾經膠囊產品質量，本研究參考中藥質量標志物以君藥為主，兼顧臣佐使藥的確定原則，采用波長切換技術，選取舒爾經膠囊方中君藥香附所含標志性成分α-香附酮，臣藥白芍，佐藥赤芍、牡丹皮所含代表性成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷，佐藥延胡索所含主要活性成分延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿為定量測定研究指標，為舒爾經膠囊多指標控制質量標準的提高和完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

芍藥苷對照品(批號：110736-201842，物質數字識別號碼：23180-57-6，純度：97.4%)、α-香附酮對照品(批號：110748-201815，物質數字識別號碼：473-08-5，純度：99.7%)、延胡索乙素對照品(批號：110726-201819，物質數字識別號碼：2934-97-6，純度：99.8%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷對照品(批號：14062505，物質數字識別號碼：39011-91-1，純度：99.95%)、四氫小檗堿對照品(批號：PRF8050941，物質數字識別號碼：522-97-4，純度：98.81%)均來源于成都普瑞法科技開發有限公司；芍藥內酯苷對照品(批號：18040323，物質數字識別號碼：39011-90-0，純度：98.5%)、紫堇堿對照品(批號：17110821，物質數字識別號碼：518-69-4，純度：99.6%)來源于上海同田生物技術股份有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

舒爾經膠囊(規格：每粒裝0.5 g，批號分別為：180601、180901、181004)來源于海南博大制藥廠。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脫(0～16.0 min，15.0%A；16.0～33.0 min，15.0%～38.0%A；33.0～42.0 min，38.0%～70.0%A；42.0～67.0 min，70.0%～78.0%A；67.0～75.0 min，78.0%～16.0%A)；檢測波長分別為230 nm[8-10](0～33.0 min檢測氧化芍藥苷、芍藥內酯苷和芍藥苷)、242 nm[11](33.0～42.0 min檢測α-香附酮)和280 nm[12-14](42.0～75.0 min檢測延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿)；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液及樣品的制備

2.2.1 對照品儲備溶液 精密稱取氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿各對照品適量，用70%乙醇制成單組分對照品儲備溶液(氧化芍藥苷0.858 mg·mL-1、芍藥內酯苷3.414 mg·mL-1、芍藥苷5.198 mg·mL-1、α-香附酮0.672 mg·mL-1、延胡索乙素0.294 mg·mL-1、紫堇堿0.238 mg·mL-1、四氫小檗堿0.192 mg·mL-1)。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密量取各單組分對照品儲備溶液2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用70%乙醇制成混合對照品溶液(氧化芍藥苷42.9 μg·mL-1、芍藥內酯苷170.7 μg·mL-1、芍藥苷259.9 μg·mL-1、α-香附酮33.6 μg·mL-1、延胡索乙素14.7 μg·mL-1、紫堇堿11.9 μg·mL-1、四氫小檗堿9.6 μg·mL-1)。

2.2.3 舒爾經膠囊樣品溶液 取舒爾經膠囊適量，傾出內容物，混勻，取約1.0 g，精密稱定，精密加70%乙醇25 mL，密塞，稱質量，加熱回流[8-9，12-14]提取45 min，放冷，用70%乙醇補足減失質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得舒爾經膠囊樣品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 按舒爾經膠囊處方比例及制備工藝，分別制備缺香附陰性樣品、缺延胡索陰性樣品和缺白芍、赤芍、牡丹皮陰性樣品，再按2.3項下方法制備3種陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適應性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、舒爾經膠囊樣品溶液和3個陰性樣品溶液適量，按照2.1項下色譜條件依法進樣測定，記錄色譜圖。結果所記錄色譜圖基線平穩，待測成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿與其他峰均能達到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數按所測定色譜峰計均>4000，3種陰性樣品對測定無干擾，色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.舒爾經膠囊樣品；C.缺白芍、赤芍、牡丹皮陰性樣品；D.缺香附陰性樣品；E.缺延胡索陰性樣品；1.氧化芍藥苷；2.芍藥內酯苷；3.芍藥苷；4.α-香附酮；5.延胡索乙素；6.紫堇堿；7.四氫小檗堿。圖1 混合對照品和舒爾經膠囊HPLC圖

2.3.2 線性關系考察 精密吸取2.2.1項下單組分對照品儲備溶液各2.0 mL，置于20 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，制成線性關系考察混合對照溶液，再精密吸取線性關系考察混合對照溶液A各適量，用70%乙醇分別稀釋2、4、8、16、20倍，制成系列濃度的線性關系考察混合對照溶液，依法進樣，測定氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，以氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的質量濃度分別對相應峰面積進行線性回歸，回歸方程、r、線性范圍見表1。

表1 舒爾經膠囊7種成分的回歸方程、r及線性范圍 μg·mL-1

2.3.3 精密度試驗 取2.2.2項下的混合對照品溶液，按照上述色譜條件進行測定，連續進樣6次，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，RSD以其峰面積計分別為0.88%、0.74%、0.60%、0.95%、1.07%、1.14%和1.25%。

2.3.4 重復性試驗 取同一批次舒爾經膠囊適量，按照2.2.3項下方法平行制備樣品溶液6份，再按照上述色譜條件進行測定，計算氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿含量，RSD以其含量計分別為1.20%、0.43%、1.01%、1.35%、1.47%、0.82%和1.26%。

2.3.5 穩定性試驗 取同一份樣品溶液，室溫下0、2、4、6、10、16 h，按照上述色譜條件進行測定，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，結果舒爾經膠囊樣品溶液室溫下16 h內穩定，待測成分峰面積的RSD分別為0.79%、0.65%、0.54%、1.03%、1.12%、0.18%和1.46%。

2.3.6 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的舒爾經膠囊適量，傾出內容物，混勻，取9份，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液(氧化芍藥苷0.278 mg·mL-1、芍藥內酯苷1.148 mg·mL-1、芍藥苷1.782 mg·mL-1、α-香附酮0.244 mg·mL-1、延胡索乙素0.106 mg·mL-1、紫堇堿0.084 mg·mL-1、四氫小檗堿0.052 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份(約相當于樣品含量的50%、100%、150%)，按照2.2.3項下方法制備加樣回收樣品溶液。按照上述色譜條件進行檢測，計算回收率及相應的RSD，檢測計算結果見表2。

2.3.7 樣品含量測定 取3批次的舒爾經膠囊適量，按2.2.3項下方法每個批次平行制備3份舒爾經膠囊樣品溶液，在2.1色譜條件下依法進樣測定氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的峰面積，計算待測成分含量，結果見表3。

表2 舒爾經膠囊7種成分的回收率(n=9)

續表2

表3 舒爾經膠囊中7種成分含量測定結果 mg·g-1

3 討論

待測成分的選擇：舒爾經膠囊由香附、白芍、赤芍、延胡索、柴胡、當歸、牡丹皮等11味中藥加工而成，方中香附疏肝解郁、調經止痛，為君藥；白芍養血柔肝、理氣止痛，當歸活血補血，柴胡疏肝升陽，合為臣藥；赤芍、牡丹皮、桃仁清熱涼血、活血化瘀，延胡索、益母草活血止痛，陳皮理氣健脾，合為佐藥；牛膝逐瘀通經、引血下行，為使藥。諸藥合奏，共達疏肝活血、調經止痛之功效。本研究參考中藥質量標志物以君藥為主，兼顧臣佐使藥的確定原則，選取君藥香附、臣藥白芍及佐藥赤芍、牡丹皮和延胡索為研究對象，香附為莎草科植物莎草的干燥根莖，主要含萜類、黃酮類、酚類、生物堿、揮發油類等化合物，α-香附酮為其特征性成分；白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷等單萜類成分為其主要活性成分；赤芍為毛莨科植物芍藥或川赤芍的干燥根，牡丹皮為毛莨科植物牡丹的干燥根皮，均含有芍藥苷、氧化芍藥苷等成分；延胡索為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿等異喹啉類生物堿為其主要有效成分。本研究選取舒爾經膠囊香附所含α-香附酮，臣藥白芍、佐藥赤芍、牡丹皮所含氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷，佐藥延胡索所含延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿為定量測定指標，為全面評價舒爾經膠囊提供數據支持。

流動相的確定：實驗過程中，以待測成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的分離度、色譜峰的尖銳程度、對稱程度以及色譜圖基線平穩情況等為指標，首先對比考察了甲醇-水流動相體系[11，15]、乙腈-水流動相體系，結果顯示，乙腈-水流動相體系下待測成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿分離度、峰形及色譜圖基線較甲醇-水流動相體系下效果好，但所測成分芍藥內酯苷、延胡索乙素和四氫小檗堿色譜峰存在拖尾現象；在此基礎上分別考察了乙腈-0.1%冰醋酸溶液流動相體系[9，13]和乙腈-0.1%磷酸溶液流動相體系[8，10，12]，通過對流動相比例的不斷摸索研究，最終確定采用乙腈-0.1%冰醋酸溶液為流動相，按照文中2.1項下流動相比例進行梯度洗脫，實現對舒爾經膠囊中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的同時測定。

本實驗首次建立一種HPLC波長切換法同時測定舒爾經膠囊中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿的含量，實現了對舒爾經膠囊多種有效成分的質量控制。