基于熵權法對千金子-甘草不同配伍比例的化學成分變化及體外肝毒性研究△

張景珍，崔曰新，王思雨，王新杰，張瑤，高慧，蘭曉燕，王英姿

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

千金子為大戟科植物續隨子EuphorbialathyrisL.的干燥成熟種子，味辛，性溫，有小毒；歸肝、腎、大腸經；具有瀉下逐水、破血消癥，外用療癬蝕疣的功效；用于二便不通、水腫、痰飲、積滯脹滿、血瘀經閉，外治頑癬、贅疣[1]。研究表明千金子中含有多種化學成分，具有廣泛的藥理活性，常用于治療白血病、晚期血吸蟲病腹水、毒蛇咬傷、膀胱癌、銀屑病等疾病[2-4]。甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、 脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，味甘，性平；歸心、肺、脾、胃經；具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的功能，在中醫臨床、方藥配伍中應用廣泛，有“十方九草”之說，被譽為“國老”“眾藥之王”。千金子與甘草臨床合用報道較多的成藥有周氏回生丸(《中華人民共和國藥典》一部)，用于霍亂吐瀉，痧脹腹痛；時疫救急丸(中藥部頒標準)用于暑濕霍亂，頭暈發熱，脘腹脹痛，惡心嘔吐，腸鳴泄瀉。目前尚未有關兩者配伍后的不良反應數據和報道，且關于兩者的配伍研究也極少[5-6]，未見有對其不同配伍比例的研究報道。

“十八反”屬于中藥“七情”中的相反配伍，為中藥用藥禁忌的一種，是中藥藥性理論的重要組成部分，是中藥合理用藥的重要內容，對指導中藥臨床用藥具有重要意義[7-8]。但“十八反”是否為絕對禁忌，古代文獻記載及現代研究均無確切定論，存在一定爭議[9-12]。“十八反”中的甘草反海藻、大戟、甘遂、芫花，雖為配伍禁忌但臨床應用情況居多，甘草與海藻的配伍多用于治療瘰疬、癭證、痹證、肺脹等疾病，而甘草與大戟、甘遂、芫花等藥的配伍常用來治療水腫臌脹、痰飲咳喘等疾病[11，13-15]。文獻表明，反藥藥對在不同劑量配比時，可能會出現毒性的協同、相加或拮抗作用；在適當的配伍組方后，“十八反”藥物可能并不是絕對的配伍禁忌[16]。自古以來千金子就與京大戟、甘遂等同列為利水要藥，與大戟、甘遂等藥性、功效相似，且具有結構相似的二萜類成分，對于甘草與千金子合用時是否存在共性的配伍禁忌規律值得探究。目前，關于甘草與大戟、甘遂、海藻、芫花等配伍的研究居多，而對于甘草與千金子的配伍研究還較少，有待于進一步探究。故本研究是基于“十八反”中的“藻戟遂芫俱戰草”，即甘草反海藻、大戟、甘遂、芫花，對千金子與甘草合用進行相關探索研究。

熵權法是一種根據各項指標觀測值所提供信息量的大小來確定指標權重的客觀賦值方法[17-18]，是客觀賦權法的一種，該方法以客觀條件為基礎，由評價指標來確定指標權重，具有反映數據中隱含信息，增強指標分辨意義、增強指標差異性，避免選用指標的差異過小所造成的數據分析困難，全面反映各類信息等優勢。熵權法可避免主觀賦權法主觀性和不確定性強的弊端，目前在中藥的質量控制及工藝優選中已有相關應用[17-23]，將其用于中藥多指標綜合評價優選中可以有效彌補主觀隨意性較大的缺陷，對促進中藥的研究開發具有重要意義。

本研究選取千金子中的主要毒效成分千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3[24-26]及甘草中的有效成分甘草苷與甘草酸單銨水合物[27-29]為指標性成分，根據臨床應用方劑中甘草與其他中藥配伍時最常用配比、周氏回生丸和時疫救急丸中兩者配比以及《中華人民共和國藥典》中兩者的規定劑量，選取甘草-千金子的配伍比例分別為1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1。基于大戟科中藥多具肝腎毒性[30-34]，擬通過不同配伍比例中的指標成分變化及肝細胞毒性實驗，利用熵權法對甘草-千金子不同配伍比例進行綜合評分優選，探討兩者合用甘草對千金子肝細胞毒性的影響，為甘草、千金子臨床應用組方及進一步研究提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國賽默飛高效液相色譜儀；Chromeleon?變色龍色譜數據系統；BSI10型萬分之一電子天平(德國賽多利斯集團)；KH7200DB型數控超聲波清洗機(昆山禾創超聲儀器有限公司)；Research plus 單道可調量程移液器(德國Eppendorf)；倒置相差顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；生物安全柜(海爾集團)；熒光分光光度計、酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；離心機(德國Eppendorf)；Milli-Q 純水機(Millipore)。

1.2 試藥

千金子飲片購自安徽亳州滬譙中藥飲片廠(批號：1203070692，產地：江西)，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為大戟科植物續隨子E.lathyrisL.的干燥成熟種子，甘草飲片購自北京仟草中藥飲片有限公司(批號：180706013，產地：新疆)，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為豆科植物甘草G.uralensisFisch.的干燥根和根莖。對照品千金子素L1(批號：111789-200901，純度：99.3%)、千金子素L2(批號：111790-200901，純度：98.5%)、千金子素L3(批號：111791-200901，純度：98.6%)購于中國食品藥品檢定研究院；對照品甘草苷(批號：551-15-5，純度：94.2%)和甘草酸銨(批號：53956-04-0，純度：94.2%)購于上海詩丹德標準技術服務有限公司。細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；培養基、血清、胰酶、雙抗、PBS均購自賽默飛世爾科技有限公司；實驗用水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。

1.3 細胞株

LO2細胞來源于中國科學院生物物理研究所。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

精密稱取千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3對照品適量，加甲醇溶解，配制成1.032 mg·mL-1千金子素L1、1.026 mg·mL-1千金子素L2、1.012 mg·mL-1千金子素L3的對照品儲備液。

精密稱甘草苷、甘草酸銨對照品適量，加70%乙醇水溶解，配制成1.026 mg·mL-1甘草苷、1.014 mg·mL-1甘草酸銨的對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備

按1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1比例取甘草(過四號篩)-千金子(適當粉碎)共1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90 mL 70%乙醇水，稱質量，超聲處理25 min(功率 250 W，頻率 50 kHz)，放冷，稱質量，補足減失質量，0.45 mm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

按1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1比例取甘草(過四號篩)-千金子(適當粉碎)共1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90 mL 70%乙醇水，稱質量，超聲處理25 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，稱質量，補足減失質量，抽濾，減壓回收乙醇，60 ℃真空干燥濃縮成浸膏。精密稱取不同配伍比例藥物浸膏各50 mg，分別加入10 mL 磷酸緩沖液(PBS)溶解，得不同配伍比例的藥物溶液(5 mg·mL-1)，再稀釋成不同比例的藥物溶液(50 mg·mL-1)。配制好的各供試品溶液用0.22 mm的濾膜過濾，備用。

2.3 色譜條件

2.3.1 千金子含量測定色譜條件 色譜柱：ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～5 min，75%A；5～35 min，75%～70%A；35～45 min，70%～85%A；45～60 min，85%～90%A；60～65 min，90%～75%A)；檢測波長：275 nm；流速：1 mL·min-1；溫度：25 ℃；進樣量：20 mL。

2.3.2 甘草含量測定色譜條件 色譜柱：ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%的磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～8 min，18%A；8～20 min，18%～30%A；20～30 min，30%～50%A；30～31 min，50%～100%A；31～35 min，100%～18%A；35～45 min，18%A)；檢測波長：237 nm；流速：1 mL·min-1；溫度：35 ℃；進樣量：20 mL。

在上述色譜條件下檢測對照品溶液、甘草單煎液、千金子單煎液、甘草-千金子合煎液，HPLC圖見圖1～2。

2.4 細胞培養

將解凍復蘇的LO2肝細胞培養于DME(含10%胎牛血清和1%雙抗)培養基中，置于37 ℃、5%CO2、70%～80%濕度的細胞培養箱中培養。待細胞密度達80%～90%，即按1∶4的比例進行細胞傳代，每隔1 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別精密吸取2.1項下配制的千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸銨對照品溶液，稀釋得系列濃度的各對照品溶液。按2.3項下色譜條件進樣分析，計算得線性回歸方程見表1，結果千金子素L1在5.16～103.20 mg·mL-1、千金子素L2在1.03～51.30 mg·mL-1、千金子素L3在5.06～101.20 mg·mL-1、甘草苷在2.05～205.20 mg·mL-1、甘草酸銨在10.14～608.40 mg·mL-1峰面積與濃度線性關系良好。

注：A.千金子素L1、L2、L3混合對照品；B.千金子單煎；C.千金子-甘草合煎；1.千金子素L1；2.千金子素L2；3.千金子素L3。圖1 千金子素L1、L2、L3 HPLC圖

注：A.甘草苷、甘草酸銨混合對照品；B.甘草單煎；C.千金子-甘草合煎；1.甘草苷；2.甘草酸銨。圖2 甘草苷、甘草酸銨HPLC圖

表1 甘草與千金子中各指標成分的線性關系考察結果(n=6)

2.5.2 精密度試驗 取2.1項下配制的對照品溶液，按2.3項下色譜條件測定，進樣20 mL，測定峰面積值，連續進樣6次，計算千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.19%、0.25%、0.26%、0.32%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 取2.2項下制備的供試品溶液，按2.3項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h，進樣20 mL，測定峰面積值，計算千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸銨的RSD分別為1.53%、0.36%、0.68%、0.40%、0.32%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗 按2.2項下供試品溶液的制備平行制備6份供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣20 mL，測定峰面積值，計算得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸銨的RSD分別為0.56%、1.58%、0.21%、0.61%、0.95%，表明方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱量已知含量的甘草-千金子(1∶1)粉末，平行6份，精密加入與樣品中含量相當的對照品，按2.2項下制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表2。

2.6 樣品成分溶出率測定

取2.2項下制備的各供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣20 mL，測定峰面積值，計算各成分溶出率，結果見表3。

2.7 CCK-8法測定甘草與千金子不同配伍比例對LO2細胞的毒性

取對數生長期的細胞，消化后接種于96孔板中，每孔接種5000個細胞，將96孔板在培養箱中培養過夜。實驗組按50 mg·mL-1的藥物質量濃度和千金子∶甘草(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶0、0∶1)藥物配伍對細胞進行處理，每組設置5個平行，處理48 h，處理結束后棄去含藥培養液，向每孔中加入CCK8溶液(每孔100 mL加入10 mL CCK8)。實驗同時設置空白組(加入相應量的培養基和CCK8溶液，不加細胞和藥物)和對照組(加入相應量的培養基、CCK8溶液和細胞，不加藥物)，5個平行。在37 ℃孵育1 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)。根據測得的A值按公式(1)計算細胞相對存活率。

表2 甘草和千金子中各指標成分的加樣回收率試驗結果 %

(1)

2.8 細胞形態學觀察

取對數生長期的細胞消化后接種于96孔板中，每孔接種5000個細胞，將96孔板在培養箱中培養過夜。實驗組按50 mg·mL-1的藥物質量濃度和千金子∶甘草(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶0、0∶1)藥物配伍對細胞進行處理，培養48 h后，放置于倒置顯微鏡下觀察 LO2 細胞形態及生長情況并拍照。

2.9 數據分析

2.9.2 熵權法客觀賦權 1)數據標準化：假設給定了K個指標X1，X2……XK，其中Xi={x1，x2……xn}。假設對各指標數據標準化后的值為Y1，Y2……YK，那么Yij=(Xij-min(Xi))/(max(Xi)-min(Xi))。2)求各指標的信息熵Ej：Ej=-ln(n)-1。其中pij=Yij/，如果pij=0，則定義。3)確定各指標權重Wi：Wi=(1-Ei)/(k-∑Ei)(i=1，2……k)。

3 結果

3.1 甘草與千金子不同配伍比例中各成分溶出率測定結果

對甘草與千金子不同配伍比例的供試品溶液進行測定，各指標成分的溶出率測定結果見表3。由實驗結果可知甘草與千金子以不同比例配伍后對甘草苷、甘草酸銨、千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3等主要指標成分的溶出率有不同程度的影響，提示甘草與千金子配伍后毒效作用的改變可能與其主要化學成分的變化有關。

3.2 甘草-千金子不同配伍比例正常肝細胞LO2的相對存活率

用CCK-8法測定甘草-千金子不同配伍比例對正常肝細胞LO2的毒性作用，由結果可知隨著配伍比例中甘草比例的增加，細胞的相對存活率增加，說明甘草對細胞的存活有積極作用，結果見表4。

表3 甘草與千金子不同配伍比例中各指標成分的溶出率測定結果

表4 甘草與千金子不同配伍比例對正常肝細胞LO2的增值抑制率

3.3 細胞形態學檢測

倒置顯微鏡下觀察，甘草單提組細胞生長良好，大小均一，細胞數目與空白組無明顯差別，而千金子單提組、甘草-千金子不同配伍比例組細胞存在不同程度的皺縮，細胞數目有不同幅度的減少，其中以千金子單提組與甘草單提組和空白組差別最大，說明甘草對細胞生長基本無影響，千金子可明顯抑制細胞的生長影響細胞凋亡；與千金子組比較，兩者以不同比例配伍后各組可減少細胞的凋亡數目，結果見圖3。

注：A.空白組；B.甘草組；C.千金子組；D.甘草-千金子(4∶1)；E.甘草-千金子(2∶1)；F.甘草-千金子(1∶1)；G.甘草-千金子(1∶2)；H.甘草-千金子(1∶4)；比例尺=1000 μm。圖3 各組LO2細胞形態圖

3.4 甘草與千金子中各指標成分與細胞的相對存活率相關性分析

將指標成分千金子素L1、L2、L3，甘草苷和甘草酸銨的含量分別與細胞相對存活率做相關性分析，結果表明千金子素L1、L2、L3與細胞相對存活率呈負相關，甘草苷、甘草酸銨與細胞相對存活率呈顯著正相關，結果見表5。

表5 甘草和千金子中各指標成分與細胞相對存活率的相關性結果(n=7)

注：*P<0.05。

3.5 熵權法計算得各指標成分權重及不同比例得分

采用熵權法計算各指標成分的權重，并對甘草-千金子不同配伍比例進行綜合評分比較，結果千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷和甘草酸銨的權重依次為0.30、0.22、0.18、0.17和0.12，甘草-千金子4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4各配伍比例的得分依次為2.97、2.75、2.99、2.71和2.82，得到綜合評價排序為1∶1、4∶1、1∶4、2∶1、1∶2。

4 討論

中藥本身成分較多，而配伍后的成分更為龐雜，藥物間的相互關系也異常復雜。本實驗通過對甘草-千金子不同配伍比例下主要化學成分的變化進行研究，初步探討甘草-千金子配伍變化的物質基礎，結果表明甘草與千金子以不同比例配伍后甘草苷、甘草酸銨、千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3等主要指標成分的溶出會發生不同的變化，甘草苷與甘草酸銨相對于甘草單提組溶出率增加，而千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3相對于千金子單提組普遍減小，提示其有效成分的變化可能與配伍前后毒效作用不一有關。此外，用CCK-8法從細胞形態學和細胞活力角度測定甘草-千金子不同配伍比例對正常肝細胞LO2的毒性作用，發現千金子單藥對正常肝細胞LO2有抑制作用，甘草與千金子配伍后可減輕千金子的細胞抑制作用，且隨著配伍比例中甘草比例的增加減緩作用增強。通過相關性分析并利用熵權法計算各指標成分的權重及對不同配伍比例進行綜合評分，得甘草與千金子配伍比例1∶1時綜合評分最高，即基于化學成分變化及體外細胞毒性研究得兩者的最佳配伍比例為1∶1時可有效降低千金子的體外肝細胞毒性作用。

“十八反”為中藥配伍禁忌的主要內容，但兩相反藥物配伍使用在古代中醫方劑和現代臨床中均有相應的應用。綜上所述，本實驗基于中藥“七情”配伍規律，從物質基礎及細胞角度對甘草-千金子不同配伍比例的化學成分及體外細胞毒性進行研究，結合客觀性較強的熵權法對其配伍比例進行綜合評分優選，初步對甘草-千金子不同比例配伍進行了研究，為其他藥物配比的研究提供新的研究思路與方法。本實驗數據處理時，采用熵權法對各權重指標進行客觀賦權，與主觀賦權法相比，權重數據完全來源于實驗所得數據的整理、計算與分析，其得到的權重系數可靠性更高，可以客觀地反映出實際數據的內在規律，從而對實驗結果做出客觀評價，使實驗結果更準確[35-36]。僅有的2篇文獻報道表明，千金子與甘草合用在腸黏膜損傷方面能夠體現“增毒”的配伍禁忌現象，而在腸屏障功能、腸道運動調節功能及系統炎癥方面未見配伍前后的顯著差異[5-6]。本實驗結果表明，在適當的比例配伍組方后，“十八反”藥物可能并不是絕對的配伍禁忌，這與自古至今均有“十八反”同用的情況相符，前期甘遂、大戟等與甘草配伍的研究也出現毒性減弱的情況[37-38]，體現出甘草“清熱解毒，調和諸藥”的性質。分析原因有以下幾個方面，一是藥物提取方式的不同，本實驗中千金子與甘草的提取方式為合提，而此前文獻報道中的藥物為單味藥提取后合并使用及單味藥物提取物與單體成分的混合使用；二是本實驗是基于化學成分及細胞實驗的體外研究，文獻報道的研究是基于實驗動物的體內研究；三是藥物比例不同，本實驗中千金子-甘草的配伍比例與文獻中的不同。綜上所述，千金子-甘草配伍受藥材品質、炮制方法、配伍比例、藥物劑型及機體等多種因素影響且作用機制復雜，故需要從體內外物質基礎變化、量-效-毒關系、成分-靶點-通路等方面對千金子-甘草的配伍作用機制進行深入探討，以期能科學、客觀地評價兩者配伍應用，并為兩者臨床合理安全用藥提供理論依據。