不同發酵時間對酵母發酵的影響

吳雪君，劉黔霞*，張 紅，楊曉健，劉美霞，王鳳霞*

（1.甕福（集團） 有限責任公司，貴州 貴陽 550000；2.中低品位磷礦及伴生資源高效利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550016）

酵母是一種單細胞真菌，屬于兼性厭氧型微生物。在有氧的條件下，能夠進行有氧呼吸，將糖類物質分解成二氧化碳和水；在無氧的條件下，能夠進行無氧呼吸（酒精發酵），將糖類物質分解成二氧化碳和酒精。酵母是一種天然發酵劑，在食品領域中的應用歷史悠久，以釀酒和面制品發酵為人們所熟悉，其應用已擴大到藥品、食品添加劑、保健食品、調味品、飼料、培養基成分等方面。國內外酵母開發的方向主要有三個方面：一是對傳統酵母進一步研發，提高生產技術，降低生產成本和提高原料的利用率；二是通過酵母基因表達外源蛋白，發展生物制藥；三是開發富集功能因子的功能性酵母，將營養酵母和功能性酵母深加工后制成營養保健食品。本文為驗證發酵時間對酵母菌發酵的影響特設計相關試驗。

1 實驗部分

1.1 原料及試劑

試驗菌種：酵母菌（貴州大學生命科學學院菌種保存室提供）。

試劑：磷酸二氫鉀、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、硫酸銨、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀等，以上試劑均為分析純。

培養基及試劑配制：培養基參照《微生物學實驗教程（第四版）》[4]進行配制。

YPD液體培養基：酵母粉7.5g、蛋白胨20g、硫酸銨5g、葡萄糖20g，加水1000mL，121℃，高壓滅菌30min。

1mg/mL葡萄糖標準液：準確稱取0.1g的無水葡萄糖，待完全溶解后定容至100mL。

DNS顯色液：分別取6.3g DNS和262 mL 2mol/LNaOH溶液，加至500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5g結晶酚5g亞硫酸鈉，攪拌溶解冷卻后加水定容至1000mL。貯存于棕色瓶中備用。

1.2 主要儀器和設備

精密天平、立式壓力蒸汽滅菌鍋（BXM-30R）、恒溫振蕩培養箱 (DHP-9052B)、超凈工作臺（帶紫外燈）、偏光顯微鏡、石墨加熱板（DB-XAB）、紫外可見分光光度計（PE Lambda）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母發酵

1）取活化好的菌落斜面一支，以1mL0.9%生理鹽水沖洗菌苔，待完全沖洗干凈后，吸取1mL接種到250mLYPD液體培養基中，置于30℃、120r/min的恒溫培養振蕩器，培養24h即得酵母種子液。

2）各試驗組的YPD液體培養基配制好后按照試驗要求分裝于500mL三角錐瓶中，每瓶250g，滅菌備用，共計24瓶。保留6瓶培養基不接種菌種，做為空白對照。放入4℃冰箱待測。

3）接種種子液。將剩余的培養基按接種量為4%接種，置于30℃、120r/min的恒溫培養振蕩器培養，待發酵36h、72h、108h后取出，一次取出6瓶放入4℃冰箱待測。

4）待108h發酵結束后將各組的發酵液倒入離心瓶于5000r/min離心10min待測。

1.3.2 檢測方法

1）發酵液殘糖量測定[6]：根據甘蔗總糖含量測定方法進行發酵液中殘糖量測定。取4mLDNS溶液于50mL容量瓶中，加入2mL已于5000r/min離心10min的發酵液樣品，補加純水至15mL，搖勻溶液，置于沸騰的水浴鍋中加熱5 min取出，迅速用自來水冷卻至室溫；用純水定容至50mL。以DNS試劑調零，按照吸收光譜的測定結果，選取最佳波長進行檢測。

2）酒精量測定[7]：參照國家標準黃酒中酒精含量測定方法進行發酵液中酒精量的測定。取已離心的發酵液，過0.22μm無菌水系濾膜。過濾完的液體即為待測樣品，進行氣相色譜上機檢測。

3）總酸、氨基酸態氮測定：參照國家標準黃酒中總酸、氨基酸態氮含量測定方法進行測定，產生的總酸量是以發酵36、72、108h后發酵液中總酸量減掉空白對照組中原有總酸量、氨基酸態氮量所得；產生的氨基酸態氮量是以發酵36、72、108h后發酵液中氨基酸態氮量減掉空白對照組中原有氨基酸態氮量所得。

1.3.3 數據處理方法

采用SPSS17.0軟件中對實驗數據進行分析，多重比較（LSD）確定組間差異，結果以“均值±標準誤”表示，標注相同字母（P＞0.05） 表示無差異，標注不同字母（P<0.05） 表示存在差異，EXCEL軟件作表。

2 結果與分析

2.1 發酵液殘糖量測定

2.1.1 吸收光譜的測定

檢測葡萄糖的入射光的波長應根據吸收光譜，選擇具有最大吸收時的波長為宜，選擇波長190nm到750nm進行掃描。由圖1可知，在500nm處具有最大吸收峰，因此葡萄糖含量檢測選擇max=500nm較為合適。

圖1 葡萄糖吸收光譜

2.1.2 葡萄糖標準曲線測定

在500nm波長處，以濃度為0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液，對吸光度繪制工作曲線。線性方程為：y=7.5828x-0.038，R2=0.9963.

2.2 酒精測定

發酵36、72、108h后發酵液中酒精度分別為2.07%、4.62%、7.93%（體積分數）。酒精度作為釀酒酵母發酵能力最重要的指標，與酵母糖轉化利用率相對應，糖轉化利用率高則相應酒精度高，反之糖轉化利用率低則相應酒精度低。見圖2、圖 3。

2.3 總酸、氨基酸態氮測定

總酸含量用來判定酵母產酸能力，酸類物質雖不是酒類的香氣成分，但其是主要的呈味物質。但酸含量需適中，否則將影響酒類的色、香、味。酒含有多種氨基酸，其中有些還是人體必需氨基酸。氨基酸大多自身具有甜、苦、澀、鮮等味感，還能被酵母進一步代謝生成重要風味物質高級醇，因此也作為酵母發酵能力的一項重要指標。

圖2 酒精標準曲線

圖3 不同發酵時間產酒精圖譜

2.4 發酵液指標分析結果

酵母發酵后的變化情況見表1所示。

表1 酵母發酵不同時間后指標變化結果

由表1可知，酵母發酵36、72、108h后，發酵液中殘糖量分別為：18.75、10.37、5.42g/L。發酵液中殘糖量可以反應酵母對糖的轉化利用能力，試驗初始培養基中含糖量相同，發酵結束后殘糖量低，說明酵母對糖的轉化利用率高，發酵能力強。由此說明發酵108h酵母對糖的轉化利用率比發酵36h和72h的高；酒精含量分別為2.07、4.62、7.93%vol，說明隨著發酵時間的延長，發酵液中產生的酒精越多。產總酸量分別為：3.17、5.14、5.11g/L；產氨基酸態氮量分別為0.46、0.87、0.85g/L，說明在發酵培養72h后，酵母產生的總酸量和氨基酸態氮量最高。

3 結語

由試驗結果可知，酵母菌發酵液中殘糖量隨著發酵時間延長逐漸減少；產生的酒精量隨著發酵時間的增加而增加；產生的總酸量和氨基酸態氮含量則是在發酵72h以后趨于穩定。由此可知酵母菌在不同發酵時間產生的代謝產物量不同，應根據具體需求進行發酵時間的調整。