二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法在茶葉銅含量檢測中的優(yōu)化

李 茜，樊竹青，黃竹珺，李媛媛，胡俊超，李學(xué)玲*

（1.普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000；2.云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000）

作為世界茶源，中國是世界茶葉種植生產(chǎn)和出口的主要國家。但近30年來，部分進(jìn)口國以保障食品安全為由，對我國實(shí)施不合理的綠色貿(mào)易壁壘，成為我國茶葉對外貿(mào)易的重要阻礙[1-2]。為打破綠色壁壘，保障茶葉出口貿(mào)易，我國積極應(yīng)對，出臺茶葉的綠色食品標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了銅的限量標(biāo)準(zhǔn)為w（Cu） ≤30mg/kg[3-4]。

目前茶葉中銅含量的測定多采用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、紫外分光光度法 (二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法)等方法。原子吸收光譜法，電感耦合等離子體質(zhì)譜發(fā)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法等在科研院所、高校和檢測機(jī)構(gòu)中使用較普遍，但因儀器設(shè)備昂貴，大多茶葉生產(chǎn)廠家采用二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法來完成銅含量檢測也能滿足要求。其檢測原理為二乙基二硫代氨基甲酸鈉 (DDTC)與銅在堿性溶液中反應(yīng)，可生成棕黃色絡(luò)合物，用四氯化碳萃取實(shí)現(xiàn)分光光度檢測。但DDTC與銅所生成的棕黃色Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相中易見光分解，且存在有機(jī)相萃取不完全的情況，降低了檢測的重復(fù)性和精確度[5-6]。同時本方法使用的四氯化碳是公認(rèn)的肝臟毒物，可通過呼吸道、消化道、皮膚吸入中毒，中毒大多表現(xiàn)為麻痹中樞神經(jīng)、損害肝腎、麻醉作用[7]，對操作人員身體健康具有潛在危害。解決上述問題的關(guān)鍵為增強(qiáng)棕黃色Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相中的穩(wěn)定性，簡化有機(jī)相萃取步驟。非化工級聚乙烯醇 (PVA)是一種無毒害、無副作用、安全的高分子類非離子表面活性劑。本研究旨在以聚乙烯醇 (PVA)醇羥基為親水基團(tuán)，聚乙烯鏈為親油基團(tuán)，形成膠束，保護(hù)棕黃色Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相體系中穩(wěn)定存在來優(yōu)化二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法。

1 材料和儀器

1.1 原料

普洱熟茶、普洱生茶、碧螺春、古樹茶、銀芽五種茶葉，購于普洱市茶葉貿(mào)易市場。

1.2 試劑

四氯化碳、檸檬酸銨、硫酸、氨水、檸檬酸銨、二乙基二硫代甲酸鈉 (DDTC)、酚紅指示劑、五水合硫酸銅、鎂粉、硝酸鎂、鹽酸、聚乙烯醇(PVA)為分析純。

1.3 儀器

紫外可見光分光光度計(jì) (島津公司，UV-2550)；馬弗爐 (上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠，SX2-4-10)；電子天平 (上海精科天美天平儀器廠，F(xiàn)A3204B)；鼓風(fēng)干燥箱 (上海慧泰儀器制造有限公司，DHG-9245A)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10g茶樣于坩堝內(nèi)，加入1g鎂粉，再加入10%硝酸鎂10mL，小火加熱，炭化至無煙，在馬弗爐中以550℃灰化5h至無炭粒。加適量12mol/L HCl溶解并用水定容至100mL，搖勻。

2.2 優(yōu)化法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別取 0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL銅標(biāo)準(zhǔn)使用液 (10mg/mL)于25mL比色管中，加20%檸檬酸銨1.0mL，滴入2滴酚紅指示劑，搖勻，用氨水 (1+1)調(diào)紫粉色至透明無色，加0.1%DDTC溶液1.0 mL和2%PVA 2.0mL，振搖1min后，靜置3min，以空白液調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)440nm處測樣品吸光值。

2.3 優(yōu)化法樣品測定

取1.0mL樣品消化液于25mL比色管中，以下同2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算消化液和空白液銅質(zhì)量。

計(jì)算公式如下：

式中：ρ為試樣中銅的質(zhì)量濃度 (mg/L)；A1—測定用試樣消化液中銅的質(zhì)量 (μg)；A2為試劑空白液中銅的質(zhì)量 (μg)；V1為試樣消化液的總體積(mL)。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系及靈敏度對比

據(jù)對比優(yōu)化法和原法工作曲線（如圖1所示）可見，兩種方法均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，優(yōu)化法的R2為0.9998，原法的R2為0.9994，若以吸光度A=0.01為可重現(xiàn)值時，則原法檢出限為0.0202μg/25 mL，優(yōu)化法檢出限為 0.0042μg/25 mL，優(yōu)化法的靈敏度較原法提高了近5倍。

圖1 優(yōu)化法和原法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 回收率實(shí)驗(yàn)對比

取5份茶樣分別加入其銅含量的80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品，用優(yōu)化法和原法進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化法的回收范圍在98.6%～106.7%之間，平均回收率為102.3%，原法的回收范圍在92.4%～101.4%之間，平均回收率為96.2%。由此可見優(yōu)化法回收率高于原法。

3.3 精確度對比

對5種不同的茶樣分別用優(yōu)化法和原法平行測定6次，結(jié)果見表1。根據(jù)對比標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD可知，優(yōu)化法的精密度明顯高于原法。

3.4 銅含量檢測結(jié)果對比

表1 優(yōu)化法和原法精確度對比

利用優(yōu)化法和原法分別測定市場取樣的普洱熟茶、普洱春茶、碧螺春、古樹茶、銀芽五個茶樣的銅含量，結(jié)果如表2所示。對比兩種方法檢測茶葉中銅含量可見檢測數(shù)值相近，但優(yōu)化法靈敏度高于原法。我國綠色茶葉標(biāo)準(zhǔn)NY 288-2018規(guī)定，綠色茶葉中銅含量的限值是w（Cu） ≤30mg/kg，根據(jù)結(jié)果可知，檢測的5個茶樣均符合綠色茶葉標(biāo)準(zhǔn)。

表2 優(yōu)化法與原法中銅含量的對比

4 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法因儀器簡便易得，是食品中銅離子檢測常使用的方式，但是卻存在操作復(fù)雜，利用四氯化碳等有毒試劑，污染環(huán)境，對人體有毒害性，實(shí)驗(yàn)中指示劑顯色不穩(wěn)定，萃取不完全等缺點(diǎn)。本研究通過優(yōu)化法和原法的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度、回收率實(shí)驗(yàn)的檢出限和靈敏度以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差比較可以證明溶液萃取比色法的優(yōu)化法對茶樣中銅含量的檢測更為精確。同時利用優(yōu)化法和原法分別測定了市場隨機(jī)采樣中的五種茶葉，檢測結(jié)果均低于我國綠色茶葉標(biāo)準(zhǔn)NY 288-2018限量。

優(yōu)化法的溶液萃取比色法是可行的，所以在實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化法的聚乙烯醇 (PVA)可以取代原法的四氯化碳作為Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相中的穩(wěn)定劑，提高了實(shí)驗(yàn)人員的操作安全，符合現(xiàn)代檢測環(huán)保理念。同時優(yōu)化法改進(jìn)了原法溶液萃取比色法中存在的顯色絡(luò)合物不穩(wěn)定，銅離子萃取不完全的問題，簡化了四氯化碳萃取步驟，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率，為茶葉中銅含量的檢測提供了新方法。