大黃酸聯合高壓氧對大鼠CCL4致肝纖維化的影響

孫昂昂，劉東璞

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154000；2.佳木斯大學 基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154000)

HF是慢性損傷長期反復刺激肝臟的反應過程，基本因素是肝細胞的壞死，中心環節是肝星狀細胞(HSC)的激活與增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只(180～220 g)，由佳木斯大學實驗動物中心提供，大黃酸粉劑，高壓氧裝置，兔抗鼠TGF-β1抗體、α-SMA抗體，萊卡光學顯微鏡

1.2 方法

空白對照組(O組)：僅花生油腹腔注射及生理鹽水灌胃；

模型對照組(S組)：首次以 3 mL/kg CCL 4溶液(精制花生油配置)腹腔注射，以后均 2 mL/kg 腹腔注射，2次/周，共6周；

大黃酸治療組(R組)：誘導肝損傷同模型組，首次腹腔注射 CCL 4油劑三天后大黃酸灌胃100 mg/kg，2次/周；

高壓氧治療組(H組)：誘導肝損傷同模型組，首次腹腔注射 CCL 4油劑三天后高壓氧1 kPa 1 h/次，2次/周；

大黃酸聯合高壓氧治療組(RH組)：誘導肝損傷同模型組，在給予高壓氧的同時給予大黃酸，時間和劑量不變。

每7天處死1只模型對照組取肝臟組織作肝臟病理學檢查，按照《病毒性肝炎防治方案》評判肝纖維化程度[1]，直到模型建立成功。

肝功能檢測于造模成功后分別尾靜脈采血，全自動生化分析儀檢測ALT、AST。

HE染色6周造模成功后，處死取大鼠同一部位肝組織，制備石蠟切片、HE染色觀察形態學改變。

1.3 免疫組化法檢測陽性細胞數

按試劑盒說明書操作，免疫組化檢測TGF-β1、α-SMA蛋白表達，均定位在胞質，為棕黃色顆粒樣著色。采用IPP 6.0圖像分析軟件計數。

1.4 統計學方法

應用SPSS 21.0軟件，數據以 x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P< 0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中ALT、AST水平

各實驗組均較O組升高(P<0.05)，說明肝臟均有不同程度的損傷；S組表達增加，H組、RH組較S組升高(P<0.05)，R組較S組降低(P<0.05)；RH組較H組降低，較R組升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST水平

注：*表示與O組比較，P<0.05；#表示與S組比較，P<0.05；△表示與RH組比較，P<0.05。

2.2 肝臟病理學改變

O組肝小葉結構正常；H組大量炎細胞浸潤，纖維組織增生明顯，分割破壞肝小葉；RH組肝小葉結構紊亂，較多炎細胞浸潤，纖維組織增生僅次于H組；S組纖維組織有纖維間隔形成，小葉結構部分存在；R組匯管區和周圍纖維組織輕度增生(見圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理改變(×400)

2.3 免疫組化結果

各實驗組陽性細胞數均較O組升高(P<0.05)，S組表達增加，H組、RH組較S組升高(P<0.05)，R組較S組降低(P<0.05)；RH組較H組降低，較R組升高(P<0.05)(見表2，圖2、3)。

表2 免疫組化檢測肝臟組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達陽性細胞數

注：*表示與O組比較，P<0.05；#表示與S組比較，P<0.05；△表示與RH組比較，P<0.05。

圖2 各組大鼠肝臟組織TGF-β1蛋白表達(×400)

圖3 各組大鼠肝臟組織α-SMA蛋白表達(×400)

3 討論

各實驗組血清ALT、AST檢測均較O組升高，說明肝臟有不同程度的損傷；HE染色：各實驗組均有不同程度的炎細胞浸潤，小葉結構紊亂，纖維組織增生，間隔形成；肝功能血清學檢測和病理學改變表明肝纖維化模型制備成功。

TGF-β1，是最廣泛和最深入研究的亞型，也是最強的致肝纖維化因子，是介導肝損傷及纖維化的最關鍵的細胞因子[2]，肝損傷后，TGF-β1表達會顯著增加。

HSC受細胞因子或炎癥因子刺激，引起表型改變，遷移復位產生過量的α-SMA，被認為是肝纖維化發病的關鍵事件。故α-SMA可作為HSC活化的特有標志性蛋白[3]。

各實驗組TGF-β1、 α-SMA蛋白均較O組升高，S組蛋白表達增加，H組、RH組較模型組升高，R組較模型組降低，RH組較H組降低；表明大黃酸可以抑制肝纖維化，其作用機制與其抗氧化、抗炎作用有關，拮抗CCL4的毒性作用，抑制TGF-β1的活性及抑制HSC活化、抗肝細胞凋亡壞死、保護內皮細胞、抑制成纖維細胞增殖及膠原合成等方面有關[5]。

研究表明，肝硬化病人30%～70%存在局部氧供應不足的現象，供血及供氧不足會導致肝損傷加重[6]，影響細胞內線粒體的代謝，而高壓氧治療可以迅速改善組織缺氧。但是，本實驗中H組肝纖維化加重，RH組肝損傷較S組重，說明高壓氧加重肝損傷大于大黃酸的抑制肝纖維化作用。可能與以下研究有關，CCL 4可以與氧氣反應生成CCL3O2·，導致細胞膜的脂質過氧化作用和細胞膜破壞，處于高壓氧狀態下會生成更多的CCL3O2·，損傷肝細胞[7]；單用高壓氧導致體內氧自由基增多，故需聯用自由基清除劑[6]；在高壓氧腎移植后缺血再灌注治療中5 h組血清肌酐較1 h、3 h組低[8]，因高壓氧使用時間不同而產生結果的差異。Nakai，Sun Y[9-10]等國內外文獻已有論述高壓氧可以迅速改善組織缺氧、減輕肝細胞損傷和炎癥化，可以從以上幾個方面繼續探究實驗結果與預期的差異，進一步深入研究，為肝纖維化藥物的研究提供實驗依據。