基于適配體/金納米粒子的“開-關”型熒光探針快速測定水胺硫磷

鄒小波 蔣彩萍 李志華 孫悅 石吉勇 李艷肖 黃曉瑋 張迪 胡雪桃 翟曉東 魏曉鷗

摘?要?基于適配體和金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）合成“開-關”型熒光探針，用于快速、靈敏、高選擇性測定水胺硫磷。5'端連接熒光素（6-Carboxyfluorescein，FAM）的發卡型水胺硫磷適配體互補鏈（Complementary strand，cDNA）通過修飾于3'端的巰基連接到AuNPs表面，FAM（熒光信號分子）與AuNPs（熒光猝滅劑）間發生熒光共振能量轉移效應 （Fluorescence resonance energy transfer，FRET），導致熒光猝滅。加入水胺硫磷適配體（Isocarbophos-binding aptamer，ICP-Aptamer）與cDNA雜交，cDNA發卡構型被打開，使熒光信號恢復。當體系中存在水胺硫磷時，ICP-Aptamer與其特異性結合，導致與cDNA解離，cDNA發卡型結構重新恢復，使熒光信號猝滅。采用透射電鏡、紫外-可見光譜、Zeta電位表征納米粒子特性，優化了實驗參數，包括pH值、ICP-Aptamer濃度、溫育時間和溫育溫度。在優化的實驗條件下，在0.02～10 μmol/L線性范圍內，水胺硫磷濃度與熒光抑制率呈良好的線性關系，檢出限為17.8 nmol/L（3σ）。將此熒光探針應于大米、菠菜樣品中水胺硫磷的測定，回收率均為92.9%～107.0%，相對標準偏差小于4.2%，表明此熒光探針在農藥的檢測和食品安全的監測中具有潛在的應用價值。

關鍵詞?熒光探針;“開-關”型;適配體;金納米粒子;水胺硫磷

1?引 言

有機磷農藥作為應用最廣泛的一類化學農藥，常被用作殺菌劑、除草劑和殺蟲劑[1]。然而，由于有機磷農藥的半衰期長，不當的使用及處理均會導致其在農作物、環境和水資源中殘留，甚至會通過食物鏈富集于人畜體內，危害人體健康，導致不孕、呼吸系統疾病、神經系統疾病等[2]。水胺硫磷是一種被普遍應用的乙酰膽堿酯酶抑制劑有機磷農藥，具有廣譜的高殺蟲毒性，主要用于防治鱗翅目、同翅目和螨類害蟲。由于其高毒性，水胺硫磷雖仍廣泛施用于棉花和水稻作物中，但現已被我國禁用于果蔬和茶葉中[3]。然而，在一些地區，水胺硫磷仍被發現大量殘留于果蔬、大米等多種農作物中。因此，建立快速、靈敏、簡便、高效的檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。

目前，對水胺硫磷的檢測主要采用儀器分析技術[4]，例如高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC[5]）、氣相色譜-質譜聯用法（Gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS[6]）等，以及免疫學檢測技術例如酶聯免疫吸附法[7]、免疫親和柱法[8]等。 這些分析方法分離能力高、靈敏度高、定量精確，但樣品前處理過程復雜、成本高、費時長，需專業人員操作處理。與熒光光譜法[9]、拉曼光譜法[10]以及電化學信號[11]相結合的納米探針，因其具有響應速度快、成本低、特異性好等特點而備受關注。納米生物探針結合了納米材料與生物活性物質，采用酶[12]、抗體[13]等生物分子作為識別元件，特異性識別待檢測物質;同時，基于納米材料（如金納米粒子[13]、碳量子點[14～15]、石墨烯[16～17]、聚苯胺[18]、磁性納米粒子[19～20]等）轉換或增強其傳感信號。

酶、抗體等生物活性分子制備困難，對環境因素敏感，對檢測的準確性有較大影響。功能性核酸（如適配體）因具有易于制備、低免疫原性、高化學穩定性等優點，已經成為研究的熱點[21]。Taghdisi等[22]制備了基于金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）、發卡型結構的適配體互補鏈以及硫堇的電化學適配體探針，當目標物Pb2+存在時，適配體互補鏈形成發卡結構，硫堇-AuNPs絡合物無法與其復合，導致體系產生微弱的電化學信號;當不存在目標物Pb2+時，硫堇-AuNPs絡合物與適配體互補鏈共軛復合，體系產生強電化學信號。Emrani等[23]構建了以發卡型結構的適配體體系為識別元件的熒光探針，用于檢測可卡因，檢出限低至0.07 ng/mL。

本研究以6-羧基熒光素（6-Carboxyfluorescein，FAM）為熒光信號分子，AuNPs為熒光猝滅劑，水胺硫磷適配體（Isocarbophos-binding aptamer，ICP-Aptamer）為識別元件，發卡型水胺硫磷適配體互補鏈（Complementary strand，cDNA）為結構型“信號開關”，制備了可特異性識別水胺硫磷的“開-關”型熒光探針。此熒光探針通過發卡型cDNA的構型變化，以及FAM-AuNPs供受體間的熒光共振能量轉移效應（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），將水胺硫磷的含量信息轉變為相應的熒光信號，實現水胺硫磷的定量檢測，并將此“開-關”型熒光探針用于大米和菠菜中水胺硫磷的定量檢測。

2?實驗方法

2.1?儀器、試劑與材料

VIS-7220N可見分光光度儀（北京瑞利分析儀器有限公司）;F-98熒光分光光度計（上海棱光技術有限公司）;QuantaMasterTM 40熒光光譜儀（美國PTI公司）;JEM-2100透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）;Nano ZS90納米粒度儀及Zeta電位儀（英國馬爾文公司）;TGL-15B高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

HAuCl4·4H2O、檸檬酸三鈉、十二烷基硫酸鈉、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（Tris （2-carboxyethyl） phosphine hydrochloride，TCEP）、二水合雙（對-磺酰苯基）苯基膦化二鉀鹽（Bis （p-sulfonatophenyl） phenylphosphine dihydrate dipotassium salt，BSPP）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）等試劑均購自鎮江華東器化玻有限公司。ICP-Aptamer （序列5'-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3'）、5'和3'端分別修飾有FAM、巰基的cDNA（序列5'-FAM-CTGCACAAGAATCGCTGCAG-C3-SH-3'）[24]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。水胺硫磷、毒死蜱、敵敵畏、樂果、馬拉硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、三唑磷、敵百蟲、啶蟲脒、吡蟲啉等農藥標準品均購于北京世紀奧科生物技術有限公司。所用試劑均為分析純，實驗用水為采用Easypure 超純水系統純化的超純水。

大米、菠菜樣品購自鎮江市超市。

2.2?“開-關”型熒光探針的制備

2.2.1?AuNPs的制備?參考Frens-Turkevich方法[25]并稍作改進，通過檸檬酸鹽還原HAuCl4·4H2O的方法制備13 nm AuNPs。將10 mL 1 mmol/L HAuCl4·4H2O溶液加入帶有回流冷凝器的圓底燒瓶中，置于恒溫電磁攪拌器，水浴加熱至劇烈沸騰，迅速加入1 mL 60 mmol/L 檸檬酸三鈉，溶液顏色由淡黃色變為無色。在100℃條件下劇烈攪拌15 min，至溶液變為酒紅色。停止加熱，冷卻至室溫。加入3 mg BSPP，并繼續攪拌15 min，防止顆粒聚集。將得到的AuNPs過0.22 μm濾膜，于4℃保存，備用。

2.2.2?熒光探針的制備?將合成的AuNPs以10000 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀物重懸于4.5 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 8.0，含0.01% 十二烷基硫酸鈉（SDS））。將10 μL 500 mmol/L醋酸緩沖溶液（pH 5.2）、20 μL 10 mmol/L TCEP（現配現用）和100 μL 100 μmol/L cDNA混合均勻，在室溫下孵育1 h，然后與上述AuNPs溶液混合，室溫下避光孵育過夜。

向上述反應溶液中加入50 μL 10 mmol/L PBS （pH 8.0，0.01% SDS，100 mmol/L NaCl），在室溫下孵育30 min，使cDNA與AuNPs復合。5000 r/min離心10 min，去除多余的cDNA。

將cDNA-AuNPs復合物重懸于10 mmol/L PBS（pH 8.0）中，使cDNA-AuNPs復合物終濃度為500 nmol/L。 在500 μL上述復合溶液中[26，27]，加入10 μL 40 μmol/L ICP-Aptamer和10 μL 10 mmol/L PBS（pH 8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，10 mol/L MgCl2，50 mmol/L Tris），60℃溫育10 min，冷卻至室溫，即達到熒光探針溶液的動態平衡。

2.3?水胺硫磷的檢測

將不同濃度的水胺硫磷標準溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 μmol/L）分別與上述熒光探針溶液混合，靜置10 min，測定熒光光譜，激發波長為495 nm。 按公式（1）計算熒光抑制率（Inhibition ratio，IR），重復實驗3次，取平均值。

2.4?大米和菠菜樣品中水胺硫磷的檢測

在10 g大米樣品中加入5 mL去離子水和20 mL乙腈，勻漿10 min后，再超聲處理30 min，使其混合均勻。過濾，65℃旋轉蒸發，進行濃縮。用PBS（pH 8.0）將濃縮液稀釋100倍，過0.22 μm濾膜，備用。菠菜樣品的預處理方法與大米樣品一致。按照2.3節方法對樣品中水胺硫磷進行檢測，并進行加標回收實驗。

3?結果與分析

3.1?檢測原理

基于發卡型cDNA的構型變化以及FAM-AuNPs供受體間的FRET效應的“開-關”型熒光探針檢測水胺硫磷的原理如圖1所示。其中，ICP-Aptamer為識別元件，FAM為熒光信號分子，AuNPs為熒光猝滅劑，cDNA為結構型“信號開關”。

3'端的巰基將發卡型cDNA通過AuS鍵連接到AuNPs上。由于發卡型cDNA5'端熒光信號分子FAM靠近猝滅劑AuNPs的表面，FAM與AuNPs之間的FRET效應成功猝滅了FAM的熒光信號。隨著ICP-Aptamer的加入，ICP-Aptamer與cDNA互補雜交，cDNA發卡型結構被打開，FAM遠離AuNPs表面，不再發生FRET，因此，伴隨顯著的熒光“開啟”，在495 nm激發波長下的FAM熒光信號恢復。當檢測體系中加入靶標水胺硫磷后，ICP-aptamer與水胺硫磷之間的特異性親和力使得ICP-aptamer優先與水胺硫磷結合，從而造成ICP-aptamer與互補的cDNA發生解鏈，cDNA發卡型結構重新恢復，FAM與AuNPs之間的FRET效應使熒光信號猝滅，熒光“關閉”。

3.2?AuNPs和熒光探針的表征

如圖2A和2B的電鏡圖所示，所制備的AuNPs呈現良好的單分散狀態。隨著發卡型cDNA組裝到AuNPs表面，復合粒子的水動力半徑由12.8 nm增加到19.8 nm。由于ICP-Aptamer體系的相對剛性結構對體系的保護以及體系達到的動態平衡，復合粒子趨于規則且穩定的條帶狀分布。由圖2C可知，隨著AuNPs和cDNA的復合，復合粒子的共振吸收峰相比AuNPs發生紅移（由521 nm紅移至534 nm），峰強變強，進一步表明發卡型cDNA成功修飾到了AuNPs表面[28]。通過測定Zeta電位值可進一步探明AuNPs和cDNA復合過程中體系的穩定性和復合粒子的表面狀況[29]。所制備的AuNPs表面帶負電（22.07 mV），當發卡型cDNA通過巰基連接到AuNPs上時，Zeta電位為45.48 mV，體系狀態逐漸趨于平衡和穩定，復合粒子粒徑變大。

3.3?熒光共振能量轉移體系

“開-關”型熒光探針通過cDNA-AuNPs供受體間的熒光共振能量轉移（FRET）效應[30，31]，實現檢測體系熒光信號的“開啟”和“關閉”。在此檢測體系中，FAM作為熒光供體，AuNPs作為受體。如圖3A所示，FAM的熒光發射峰和AuNPs的紫外吸收峰分別為518和521 nm，兩峰幾乎完全重疊;當cDNA通過3'端的巰基連接到AuNPs上時，cDNA由于自身堿基互補配對形成發夾型結構，5'端連接的FAM靠近AuNPs，AuNPs猝滅FAM熒光。通過公式（2）估算FRET猝滅效率（Q）：

式中，F0' 表示FAM的熒光強度，F'為FAM-AuNPs復合粒子的熒光強度，B是背景熒光強度。

加入AuNPs后，Q>83%，表明 AuNPs 對 FAM熒光有較好的猝滅作用。熒光壽命可作為評判一個FRET體系的關鍵因素，通過圖3B可從熒光壽命衰減動力學角度分析cDNA-AuNPs 的FRET體系。加入AuNPs后，FAM的熒光壽命由4.11 ns下降為3.37 ns，且熒光被有效猝滅，表明FAM-AuNPs供受體間為動態猝滅[32]。

3.4?實驗條件的優化

pH值、ICP-Aptamer濃度、溫育時間和溫育溫度等因素均會影響熒光探針檢測靈敏性和準確性。除pH值、ICP-Aptamer濃度、溫育時間、溫育溫度以外，固定其它實驗條件，向反應溶液加入適量 5 μmol/L水胺硫磷溶液，混合均勻。在同一體系中，通過比較熒光抑制率衡量熒光探針性能。在pH 5.0～11.0范圍內，測定不同pH值下檢測體系在水胺硫磷加入后的的熒光抑制率，結果如圖4A所示，當體系pH值為8.0時，其熒光抑制率最大;當pH值過高或過低時，由強酸堿或高離子強度引起的屏蔽效應、AuNPs的團聚現象等均會抑制FRET猝滅效率。由圖4B可知，加入10 μL ICP-Aptamer時，體系的熒光抑制率達到最大，這可能是因為ICP-Aptamer與DNA的雜交趨于飽和，繼續增加ICP-Aptamer含量，體系熒光抑制率基本不變。當溫育時間和溫育溫度分別為10 min（圖4C）和60℃（圖4D）時，體系熒光抑制率達到最大值。

3.5?“開-關”型熒光探針對水胺硫磷的靈敏檢測

在優化的實驗條件下，將“開-關”型熒光探針用于水胺硫磷的檢測。如圖5所示，在0.02～10 μmol/L的濃度范圍內，隨著水胺硫磷濃度的增大，檢測體系在518 nm處熒光值逐漸降低，熒光抑制率與水胺硫磷濃度呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.015x + 0.769 （R2=0.998），檢出限（LOD）為17.8 nmol/L （3σ），低于大多數文獻報道的方法 （表1）。

3.6?“開-關”型熒光探針對水胺硫磷的選擇性

在相同的實驗條件下，測定“開-關”型熒光探針對水胺硫磷、毒死蜱、敵敵畏、樂果、馬拉硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、三唑磷、敵百蟲、啶蟲脒、吡蟲啉等農藥的熒光信號，水胺硫磷的濃度為5 μmol/L，其它農藥的濃度為50 μmol/L。 如圖6所示，對水胺硫磷，檢測體系的熒光強度發生顯著變化，熒光抑制率為84%，檢測其它農藥時，檢測體系熒光強度均無明顯變化，熒光抑制率較低。結果表明，“開-關”型熒光探針對水胺硫磷有較好的選擇性與特異性，這主要歸因于ICP-Aptamer特有的核苷酸序列，以及特異性結合靶標前后特有的二級、三級結構，即ICP-Aptamer對水胺硫磷所具有的特異性識別的莖、環結構以及在特異性識別過程中結構的旋轉與折疊等[24]。

3.7?大米、菠菜樣品中水胺硫磷的檢測

采用“開-關”型熒光探針檢測大米、菠菜樣品中的水胺硫磷，評估其在檢測實際樣品中水胺硫磷的可行性。同時，采用氣相色譜法（GC）測定水胺硫磷含量。大米、菠菜樣品中未檢出水胺硫磷，5個添加水平下的加標回收實驗結果如表2所示，回收率為92.9%～107.0%，相對標準偏差（RSD）小于4.2%，檢測結果與GC方法一致。結果表明，本研究建立的基于適配體/金納米粒子的“開-關”型熒光探針用于水胺硫磷含量的測定，具有較好精確度和準確度。

4?結 論

基于水胺硫磷的適配體和金納米粒子，制備了“開-關”型熒光探針，在0.02～10 μmol/L的濃度范圍內，水胺硫磷濃度與熒光抑制率呈良好的線性關系。將此探針用于大米和菠菜樣品中水胺硫磷的檢測，其結果與氣相色譜法具有較好的一致性。此熒光探針具有檢出限低、操作簡單、靈敏度高、準確度高、重現性好的特點，在農藥等痕量物質的分析測定中具有良好的應用前景。

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