大鼠HIRI模型中氧化損傷和Hcy含量的研究

盧建升，田新雁，蘇 娟，呂 興，王永寬，龐 博，周 萍*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

肝缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝臟組織缺血一段時間后再恢復血液灌注，不但沒有使肝臟功能、結構恢復，反而加重其損傷程度的現象。HIRI是肝移植、休克復蘇、嚴重肝外傷及肝葉切除等過程中不可避免的，也是影響治療效果和預后的重要原因之一，嚴重時可導致患者的肝功能衰竭甚至死亡〔1-2〕。

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是體內重要的氨基酸——蛋氨酸（methionine，Met）經脫甲基等一系列反應生成的中間產物，在人體內含量極少，是一種具有細胞毒性的含硫氨基酸〔3〕。Hcy在重金屬離子（如Fe3+或Cu2+）的催化下易發生自身氧化，生成超氧化物、過氧化氫和羥自由基等活性氧參與動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓等多種疾病的發生〔4-6〕。

肝臟是代謝Hcy的主要器官，臨床研究表明，血漿Hcy水平升高與肝功能損傷存在著密切的聯系〔7〕。在HIRI過程中，Hcy是否參與了其損傷的加重，卻未見報道。故本研究將通過建立肝缺血-再灌注（24 h）損傷模型，來探討Hcy含量與氧化損傷在HIRI中的變化。

1 材料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，雄性，體質量180～220 g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，合格證號：SYXK（滇）K2015-0002，適應性飼養1周后，建立大鼠HIRI模型。

1.2藥物與試劑BCA蛋白質定量試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：20190309）；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測定試劑盒（批號：20190718）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒（批號：20190718）、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號：20190718）和丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號：20190917）均購自南京建成生物工程研究所；同型半胱氨酸（Hcy）測定試劑盒（批號：201907）、透明質酸（HA）測定試劑盒（批號：201907）和層粘連蛋白（LN）測定試劑盒（批號：201907）購自上海泛柯實業有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3主要儀器無創血管夾（上海醫療器械有限公司）；JR-30鼠恒溫實驗臺（成都泰盟軟件有限公司）；VCX130超聲細胞粉碎儀（SONICS，美國）；冷凍高速離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；快速混勻器（常州國華電器有限公司）；超低溫保存箱（海爾股份有限公司）；熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）；多功能酶標儀（Gene Company Limited，美國）；T6紫外分光光度計（北京普析）。

2 方法

2.1實驗動物分組取40只SD大鼠隨機分為3組：假手術組（S）、缺血組（I）和缺血-再灌注組（I/R）。S組開腹90 min后，根據繼續飼養0 h和24 h，隨機分為S-I組和S-I/R組，每組10只；I組僅缺血90 min不再灌注，10只；I/R組缺血90 min后，再灌注24 h，10只。

2.2 HIRI模型建立術前24 h禁食不禁水。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（6 mL/kg）麻醉大鼠，下腹正中切口，暴露出肝臟門三靜脈，根據劉俊平等〔8〕的方法，I組和I/R組采用無創血管夾夾閉肝左外側葉和中葉的肝動脈、門靜脈，阻斷入肝約70%血流，90 min后除去，S-I組和S-I/R組只進行肝蒂部干擾。S-I/R組和I/R組縫合腹部切口兩層，使大鼠從麻醉中恢復，繼續飼養24 h后取材（S-I組和I組分別開腹90 min和缺血90 min后直接取材）。大鼠手術過程中保持在鼠臺上，控制體溫在（37±0.5）℃，大鼠下腔靜脈采血（3%肝素鈉抗凝），4℃，3 000 r/min離心10 min，分離得血漿-80℃凍存備用。

2.3肝臟采取與勻漿采血結束后，遵循動物倫理道德處死大鼠，分離得大鼠肝左外側葉。取約1 g肝組織，按質量-體積為1∶9的比例加入0.9%氯化鈉溶液，在功率為60%，超聲循環5次（超聲10 s與冰浴30 s為一個循環）的條件下制備10%勻漿液，4℃，3 000 r/min離心10 min，分離得10%肝勻漿上清液，-80℃凍存備用。

2.4肝組織病理變化蘇木精-伊紅（HE）染色法取肝左外側葉部分組織，4%多聚甲醛固定24 h后，制備4μm厚切片，顯微鏡下觀察肝組織病理損傷變化。

2.5肝功能指標測定按照試劑盒說明書步驟操作，于多功能酶標儀505 nm波長測定血漿中AST和ALT活力。

2.6肝組織生化指標檢測取肝組織勻漿上清液，采用BCA法測定其總蛋白濃度。分別根據試劑盒說明書測定肝勻漿SOD活力，MDA、Hcy、HA和LN的含量。

2.7數據統計分析應用SPSS20.0統計分析軟件分析數據，計量資料均以（s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1大鼠HIRI模型建立情況通過手術阻斷大鼠左肝葉及中葉血供，致大鼠約70%肝組織缺血90 min，恢復供血0 h或24 h的損傷模型的動物存活率高，大鼠HIRI模型建立的情況見表1。

表1 大鼠HIRI模型建立情況

3.2肝組織病理變化HE染色結果顯示，S-I組和S-I/R組肝臟中央靜脈清晰完整，肝細胞呈索狀排列整齊，肝細胞大小均勻，無變性和壞死，見圖1A、B；I組肝細胞索狀排列不整齊，分布不均勻，有少量變性和壞死，肝竇擠壓變形且有明顯淤血，有炎性細胞浸潤，見圖1C；I/R組肝竇受擠壓消失，肝細胞明顯腫脹，分布不均勻，明顯的變性和壞死，有炎性細胞浸潤，見圖1D。

圖1 大鼠肝組織病理觀察（HE染色，×200）

表2 大鼠血漿中ALT和AST的活力變化（

表2 大鼠血漿中ALT和AST的活力變化（

注：與S-I組比較**P＜0.01；與S-I/R組比較##P＜0.01。

3.3大鼠肝功能的變化檢測血漿ALT和AST的活力能準確反映肝臟的損傷程度。I組和I/R組分別與S-I組和S-I/R組比較，大鼠血漿AST和ALT活力均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

3.4大鼠肝臟氧化指標的變化I組和I/R組分別與S-I組和S-I/R組比較，肝組織SOD活力均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01），MDA含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

3.5大鼠肝臟中Hcy含量的變化與S-I/R組和I組比較，I/R組大鼠肝組織Hcy含量升高，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

表3 大鼠肝組織中SOD活力變化，MDA、Hcy、HA和LN含量的變化（

表3 大鼠肝組織中SOD活力變化，MDA、Hcy、HA和LN含量的變化（

注：與S-I組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與S-I/R組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與I組比較◆P＜0.05。

3.6大鼠肝纖維化指標的變化與S-I組比較，I組大鼠肝組織HA和LN的含量變化沒有統計學意義（P＞0.05）；與S-I/R組和I組比較，I/R組大鼠肝組織HA和LN含量均升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

4 討論

在肝移植、休克和阻斷血管的肝臟切除等外科手術過程中，均可發生HIRI現象。影響HIRI的常見因素有缺血時間、缺血程度及再灌注的條件等〔9〕，若再灌注損傷嚴重，可能誘發肝炎、肝纖維化甚至肝硬化〔10〕。HIRI主要表現為肝細胞壞死，研究〔11-13〕發現其發病機制與氧化應激相關，機體產生廣泛的活性氧及脂質過氧化反應等攻擊肝細胞，造成肝細胞損傷，表現為SOD活力降低和MDA含量升高等。本研究結果顯示，與S-I/R組比較，I/R組的肝臟病理切片損傷明顯，肝細胞出現明顯的變性和壞死病變，血漿中AST和ALT也顯著增高，表明肝缺血-再灌注引起了肝損傷；I/R組肝組織中MDA的含量明顯增高（P＜0.01），I/R組MDA含量雖較I組增高但差異沒有統計學意義（P＞0.05），說明HIRI模型中對組織造成損傷，不是缺血本身引起的，而是恢復供血后過量的自由基攻擊損傷細胞造成的。

當肝臟功能不全或肝臟受損時，將會導致機體糖類、脂質類及氨基酸等代謝障礙，其中Hcy代謝也將會受阻〔14〕。Hcy是一種具有細胞毒性的含硫氨基酸，與多種疾病發生發展相關的因子〔15〕，易在金屬離子的存在下發生自身氧化，生成超氧化物、過氧化氫和羥自由基等活性氧進攻組織細胞并導致組織細胞損傷。I/R組肝組織中Hcy的含量比S-I/R組和I組均增高（P＜0.01，P＜0.05），表明在大鼠HIRI模型中，Hcy代謝受阻。據報道〔16〕，Hcy含量的升高能導致細胞發生氧化應激，在大鼠HIRI模型中Hcy可能參與HIRI的發生。此外，與S-I/R組和I組比較，I/R組肝組織中HA和LN的含量均升高（P＜0.05，P＜0.01），說明肝臟缺血-再灌注后，肝組織出現了膠原的沉積增加，與劉俊平等〔8〕研究相符，提示HIRI可能促發肝纖維化的發生。

綜上所述，肝缺血-再灌注能通過氧化應激作用引起肝損傷，Hcy含量升高，后期可能促進纖維化的發生，為肝臟疾病的研究提供理論依據。