體外培養鼠胚實驗對IVF實驗室質控的評估

彭 濤，劉永剛，李 琴

（云南九洲醫院生殖醫學科，昆明 650000）

IVF（體外受精）實驗室是輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）能否順利實施的關鍵環節，是產生胚胎的重要場所，直接決定患者接受輔助生殖技術后的結局。近年來，雖然胚胎體外培養技術得到了長足發展，但體外培養仍然無法完全模擬體內生長環境，胚胎實驗室實行嚴格的質量控制和質量保證體系，不但有利于構建穩定的培養環境，而且有助于分析對胚胎培養造成影響的因素。因此，在培養人類胚胎前需要檢測實驗室的環境以確定該實驗室是否符合使用條件，檢測培養箱的各參數以確定能否成功開展胚胎培養。最后使用科學的方法對實驗室、儀器設備、人員操作進行綜合評估。而對此綜合評估的檢測方法通常有體外培養鼠胚生物學實驗（mouse embryo assay，MEA）和人精子體外存活實驗（human spermmotility assay，HSMA）。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級昆明種小鼠購自昆明醫科大學實驗動物中心，動物合格證SCXK（滇）2015-0002。雌鼠：18只，6～8周齡，體質量25～28 g；雄鼠：8只，8～10周齡，體質量33～35 g。適應性喂養3～5 d后進行實驗。

1.2主要藥品與試劑孕馬血清促性腺激素（PMSG，寧波三生生物制品公司）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠醫藥集團公司）；精子梯度分離液（Sperm Grad），洗精受精液（G-ivf plus），卵子收集液（G-mops plus），卵裂培養液（G-1 plus），囊胚培養液（G-2 plus），胚胎培養礦物油均為瑞典Vitrolife培養液系列（瑞典Vitrolife公司）。

1.3設備與耗材IVF實驗室設備包括日本Nikon SMZ解剖顯微鏡；Nikon Ti倒置顯微鏡；日本Astec培養箱；美國Thermo 3111培養箱；VWR培養箱專用溫度計；丹麥K-system Daul-126工作站；Epoc血氣分析儀；英國G－100 CO2濃度測定儀等。培養皿、試管等耗材均為美國BD Falcon公司產品，一次性使用。

1.4方法

1.4.1 實驗室及培養箱的質控 實驗室白天清水擦洗墻面和地面，加熱后開門，大功率抽風機通風，夜間開啟層流通風，連續處理3個月〔1〕。新到培養箱使用專用消毒液擦洗后，用滅菌純水擦洗3遍進入實驗室。培養箱內水盤不加水開機設置37℃，不通氣熱處理1個月，此期間每日開門2次換氣。1個月后水盤加水通CO2氣體（純度99.99%），設定參數。每日早晚測溫度和CO2濃度，培養箱穩定后用血氣分析儀檢測洗精受精液、卵裂培養液、囊胚培養液的pH值。

1.4.2 人精子體外存活實驗 選擇20～35歲身體健康的男性患者精液，排除傳染性疾病。精液標準：液化時間20～30 min，精子密度＞20×106個/mL，PR（前向移動比率）＞32%，正常形態精子＞4%〔2〕。用精子梯度分離液和洗精受精液配制成高濃度梯度（90%）、低濃度梯度（45%）離心液。采用非連續密度梯度離心法處理精子，收集處理后精子到試管中，并調整活動精子的密度至5×106個/mL。從試管中取0.5 mL處理后的精子于標準培養管中進行精子存活實驗。將上述培養管置于培養箱25℃培養、對照管置于室溫下培養。分別在24、48、72 h后搖勻精子懸液，移液器吸取5μL精子懸液滴在MAKLER板計數精子的活動率（100%減去觀察100個方格內的不活動精子占總精子數的百分率），同樣方法計數3次，求精子活動率的平均值，然后計算存活指數（sperm motility index，SMI），SMI=測試管中向前活動精子比率/對照管中向前活動精子比率〔3〕。

1.4.3 鼠胚實驗雌鼠促排卵 小鼠購回后適應飼養3～5 d，選雌鼠4～5只，下午6點腹腔注射PMSG 10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10 IU/只，注射HCG 14 h后以頸椎脫臼法處死雌鼠，腹腔表面消毒，打開腹腔，分離卵巢與輸卵管，將輸卵管放于裝有3 mL卵子收集液的預熱3001培養皿中傳至實驗室。

1.4.4 鼠卵的采集 在體視鏡下找到培養皿中的輸卵管，用1 mL注射器劃破輸卵管壺腹部，釋放卵丘冠復合體（OCCC），在卵子收集液中，用巴斯德管將OCCC移至新的培養皿中吸吹洗滌2次后放置于受精皿的液滴中待用，受精皿預先在3001培養皿中做4個80μL受精液滴覆蓋培養油，于37℃、7%CO2濃度培養箱中過夜平衡。

1.4.5 鼠精的采集 小鼠購回后適應飼養3～5 d，于取鼠卵日上午9點將雄鼠以頸椎脫臼法處死，腹部表面消毒，打開腹腔，取出形似火柴的附睪，去掉脂肪，將附睪放于裝有3 mL洗精受精液的預熱3001培養皿中，用1 mL注射器劃開附睪尾部并擠壓，擠出精子團，用巴斯德管吸出精子團，放入2 mL洗精受精液中，于37℃、7%CO2濃度培養箱中培養30 min完成獲能。

1.4.6 常規IVF 收集上層霧狀精子懸液進行計數，上午10點按卵：精=1：1萬將精子懸液加至含卵子的受精皿液滴中開始受精，6～8 h后觀察受精情況。

1.4.7 卵胞漿內單精子顯微注射（ICSI） 將獲得的精子置于37℃、7%CO2培養箱中培養2 h后，在透明質酸酶中用巴斯德管反復吹吸OCCC脫去周圍顆粒細胞，挑選減數分裂中期Ⅱ（MⅡ）卵子放入預備好的卵子收集液滴中，將活動精子置于7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中，經尾部制動后，僅將頭先吸入顯微注射針內，頸部留在針口，尾部留在針外，將精子在持卵針上蹭掉頸和尾部，顯微注射針內只留精子頭部，用持卵針固定卵子，保持卵極體位于6點或12點位置，注射針于卵子3點位置進針，刺破卵胞膜后回吸少量胞質，然后將精子頭部注入卵細胞胞質內，用巴斯德管將完成注射的卵子轉入胚胎培養液滴。完成注射6～8 h后，倒置顯微鏡下觀察受精情況（雌雄原核出現為受精的標志），并將受精卵轉移至在37℃、7%CO2中平衡過的卵裂培養液滴中繼續培養。

1.4.8 胚胎觀察 受精后6～8 h觀察：受精卵；20 h觀察：2細胞胚胎形成；60～70 h觀察：胚胎致密化；90 h觀察：囊胚形成；5 d觀察：囊胚部分與完全擴張。記錄觀察數據〔4〕。

2 結果

2.1實驗室處理完畢后環境檢測在新裝修實驗室VOC（揮發性有機化合物）的主要有害成分可能以甲醛為主，其次是苯系化合物，它們是室內毒性最大的VOC〔5〕。實驗室通過加熱排風透氣后檢測環境中的VOC指標，參照《潔凈手術部建筑技術規范GB50333》符合使用標準，證明實驗室可以使用。見表1。

表1 胚胎實驗室環境檢測結果

2.2培養箱中pH值檢測平衡16 h洗精受精液pH值、卵裂培養液pH值、囊胚培養液pH值使用Epoc血氣分析儀測定，確定培養箱設定的CO2濃度為7%（昆明海拔1 800 m）適宜培養。見表2。

表2 培養箱中培養液pH值檢測結果

2.3人精子體外存活實驗結果在實際計數精子活率時，由于精子密度低，常規的計數精子方法容易受偶然因素影響，所以在計數時采取的方法是：先觀察并記錄在MAKLER板上100個方格內的精子總數，再單獨觀察記錄100個方格內不動精子數，最后兩數相減得到活動精子數，再用活動精子數除以總精子數得出精子活率，然后計算存活指數，最后得出結果。結果培養箱中和實驗室中的精子存活指數≥95%，培養箱處理合格。見表3。

表3 精子在培養箱和培養室中的活率及存活指數

2.4鼠胚實驗結果共進行了4批次鼠胚實驗，精卵共培養6～8 h后“拆蛋”觀察雌雄原核，即受精卵。見圖1。體外受精率平均80.9%，可能操作鼠精子過程中，由于鼠精子尾部較長影響精子的活力。鼠受精卵發育到2細胞階段胚胎的平均卵裂率是97.6%，形態見圖2。隨后發育到致密化胚胎，最后發育成囊胚。見圖3～4。囊胚的形成率平均87.1%，表明生殖實驗室設備和人員操作達到正式運行標準。見表4。

圖1 鼠受精卵

圖2 發育到2細胞階段鼠胚胎

圖3 鼠致密化胚胎

圖4 鼠囊胚

表4 體外鼠胚實驗的參數

3 討論

新建立的實驗室一定嚴格按時序依次對VOC、溫度、濕度、培養箱等實施質量控制。根據所在地氣候、海拔等條件因地制宜采取實驗質量控制方式。首先實驗室空氣質量難以控制，卻是開展工作的首要條件。空氣中VOC可導致受精失敗或者胚胎發育延遲及降低發育潛能等，而且這種影響不易直觀發現，另外還會進入培養箱造成二次影響。其次，培養箱中空氣質量可受實驗室內、管道供氣影響。培養箱使用經過質量認證的氣體純度99.99%，外接氣體濾器Coda，有效保護培養環境〔6〕。實驗室的空氣雖然經過高效過濾膜（HEPA）過濾，但是新HEPA在生產及包裝運輸中不可避免地會攜帶VOC，另外IVF實驗室的高效層流（HEPA）設備雖然可以部分換氣及過濾空氣中的塵埃粒子，但是單純的HEPA層流在正壓的條件下不能有效去除室內VOC〔7-8〕。因此，每次更換HEPA前應對HEPA進行熱處理，更換后由專業測試機構檢測實驗室懸浮粒子及空氣質量，合格后繼續使用。然后，每日檢測實驗室的溫度、濕度、培養箱的CO2濃度，保證實驗室處于穩定的條件下。新建實驗室的培養箱設置時要根據培養液平衡后實測的pH值反推設置CO2濃度。最后，在以上穩定、適宜的工作條件下實驗室開始對試劑、耗材及人員操作實施質量控制，方法是人精子存活實驗和小鼠體外受精實驗。

人精子存活實驗已被證實是一種對生殖實驗室低水平毒性敏感性檢測的有效方法，對實驗室單個因素的檢測有效，現在大多數的生殖中心均采用人精子存活實驗作為IVF實驗室專一檢測培養環境和常用試劑、耗材質量控制的手段。由于要連續觀察72 h，在操作過程中要注意精子放置穩定及避免人為操作影響，比如滴加精子在MAKLER板前搖勻，切忌吹打混勻，否則嚴重影響精子活力。

小鼠體外受精技術適用于包括實驗室環境、培養箱、試劑、耗材及人員操作水平等復合條件的檢驗。在訓練新技術人員實施ICSI操作中注意，鼠精子的尾部較長，鼠精子的斷尾操作和人精子制動是不同的，訓練時要注意區別。體外鼠胚試驗的主要判定依據為囊胚形成率和囊胚質量〔9〕。小鼠胚胎與人胚胎有幾乎相同的發育經歷，因此小鼠體外受精胚胎的整個操作過程可以成為人類生殖實驗室的模型，而且可以磨練操作人員技術，為今后開展人類輔助生殖技術奠定良好的基礎。

生殖實驗室質量控制體系是系統工程，有其先后順序及連續性，嚴格實施質量控制目的是為了保證實驗室不出現大的波動，獲得穩定的成功率。本實驗室2015年體外培養鼠胚實驗驗證合格后于當年獲得衛健委專家評審準入資格，2018年完成兩千余例，臨床妊娠率達到60%以上。