miR-149和miR-196a2在亞洲人群中與腦卒中發病關系的Meta分析

楊錫彤，徐弘揚，馬 蓉，王光明*

（1.大理大學第一附屬醫院基因檢測中心，云南大理 671000；2.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000）

腦卒中（stroke）是一種突發性的腦血液循環障礙性疾病，具有發病率高、致殘率高、死亡率高以及復發率高等特點，全球每年大約有1 500萬腦卒中的病人，其中死亡率高達20%，致殘率達50%〔1-2〕。腦卒中嚴重影響人們的生存質量與生活水平，因腦卒中引發的一系列并發癥不僅給患者帶來痛苦，同時也增加了家庭和社會的負擔。腦卒中引起的死亡人數在我國死亡人數中占第二位，同時腦卒中也是導致多數成年人殘疾、生活不能自理的原因之一。腦卒中是一種復雜的多因素引起的神經系統疾病，其中包括不可改變的因素（遺傳因素）以及可改變的因素（環境因素），但是這些因素都不能解釋腦卒中的發病機制。而流行病學的研究認為腦卒中的發生與遺傳因素有較大的關系〔3〕。

微小RNA（miRNAs）是一類內源性非編碼小分子RNAs，在真核細胞中主要是由19～25個核苷酸組成，通過結合到目的基因信使RNA（mRNA）3’非編碼端，在轉錄后調節基因的表達，從而miRNAs參與了一系列重要的生命進程，包括細胞增殖、細胞發育、細胞分化、細胞凋亡和新陳代謝等〔4-5〕。單核苷酸多態性（SNP）是常見的遺傳變異之一，SNP存在于前體mir-RNA（pre-miRNAs）能影響成熟miRNAs的表達，通過目的基因改變多種生物功能。當前的研究表明SNP的位點存在于4種前體mir-RNAs，包括miR-146a C＞G（rs2910164），miR-149 T＞C（rs2292832），miR-196a2 T＞C（rs11614913）和miR-499 A＞G（rs3746444），并且能與多種影響人類健康的疾病密切相關，例如腫瘤、高血壓、心血管疾病和糖尿病〔6-7〕。近來的研究發現miR-149 T＞C，miR-196a2 T＞C等位基因可能是遺傳的易感因素〔8-9〕。4種microRNAs會引起血管損傷反應，在循環系統中與血栓形成或炎癥通路有關聯〔10〕。miR-149 T＞C，miR-196a2 T＞C基因多態性與腦卒中有相關性，但不同人群、不同地區存在差異性和不確定性，因此本研究擬通過對已發表的miR-149 T＞C和miR-196a2 T＞C基因多態性與腦卒中的相關性研究進行Meta分析，以得出較為客觀的結論。

1 資料與方法

1.1資料來源與檢索策略電子檢索PubMed、Web of Science、CBM及中國知網、萬方、維普數據庫，檢索時間從建庫到2018年11月，獲取有關microRNAs基因多態性和腦卒中的文章。為提高文獻的查全率和漏查率，分析過程中將進一步對入選研究的參考文獻進行擴大檢索，輔以文獻追溯法查找相關文獻，以提高Meta分析對文獻查全率的要求。英文檢索詞包括microRNAs、miR-149、miR-196a2、polymorphism、SNP、stroke、ischemic、IS、cerebrovascular disease、brain hemorrhage、intracranial hemorrhage、cerebral hemorrhage、cerebral infarction，中文檢索詞包括miR-149、miR-196a2、微小RNA、基因多態性、腦卒中、腦缺血、腦血管疾病、腦出血、腦梗死、腦梗塞。以PubMed為例，具體檢索策略如下：

#1 miR-149 ORmiR-196a2

#2 polymorphism ORSNP

#3 stroke OR ischemic ORcerebrovascular

disease ORbrain hemorrhage ORintracranial

hemorrhage ORcerebral hemorrhage ORcerebral

infarction

#4 case-control ORcase control

#5#1 AND#2 AND#3 AND#4

1.2文獻納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ①研究對象：評估miR-149、miR-196a2基因多態性和腦卒中發病的相關性；②研究設計：文章為病例對照研究；③干預措施：病例組為腦卒中患者，對照組為健康人群；④足夠充分的數據可用于計算OR值；⑤對照組基因型分布符合HWE（Hardy-Weinberg Equilibrium）遺傳平衡定律。

1.2.2 排除標準 ①重復研究、發表的文獻；②對照組不符合HWE遺傳平衡；③數據描述不清或樣本資料交代不清，統計方法不恰當；④腦卒中診斷不明確或沒有根據國際公認的標準；⑤綜述文獻；⑥非中、英文文獻。

1.3質量評估對納入文獻的質量評價采用Newcastle-Ottawa Scale（NOS）評價，通過入選人群、組間可比性、暴露因素測量3個方面共8個條目對文獻質量進行評價，滿分為9分，6分及以上認為是高質量文獻〔11-12〕，①病例確定是否恰當（1分）；②病例的代表性（1分）；③對照組的選擇（1分）；④對照組的確定（1分）；⑤實驗設計和數據統計分析時考慮病例組和對照組的可比性（2分）；⑥暴露因素的確定（1分）；⑦病例組和對照組暴露因素的確定方法相同（1分）；⑧無應答率（1分）。

1.4數據提取參考Cochrane協作網推薦的方法編制資料提取表，由兩名研究者獨立篩選文獻、提取資料并進行交叉核對，如有不一致觀點通過討論進行解決。提取資料的主要內容為：①文獻的基本特征（包括文題、年份、研究者姓名等）；②所納入文獻研究對象的基本特征、干預措施和結局指標。研究特征：研究地區和人群特征、研究組和對照組的例數和年齡特征；數據提取：研究組和對照組的各基因型的分布情況。

1.5統計分析采用Stata12.0進行Meta分析，本Meta分析對于計數資料的效應指標選取比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）表示。異質性檢驗的檢驗方法采用Q檢驗和I2統計量，如果異質性檢驗結果P≥0.05、I2＜50%，表示各研究間沒有異質性，選用固定效應模型，計算合并比值并繪制森林圖；如果異質性檢驗結果P＜0.05、I2＞50%，表示研究間存在異質性，選用隨機效應模型。計算合并的OR和95%CI，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1納入的文獻基本特征初步檢索出文獻65篇，其中PubMed 13篇，Web of Science 8篇，CBM 11篇，中國知網29篇，萬方3篇，維普1篇。按照文獻納入排除標準進行篩選，最終剩余8篇文獻。見圖1。文獻對照組都符合HWE檢驗，共計6 472例研究對象，其中病例3 332例，對照3 140例，納入研究的基本特征及對照組的HWE檢測見表1～2。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 Meta分析的結果

2.2.1 miR-149 rs2292832 對5種遺傳學模型（C vs.T，CC vs.TT，CT vs.TT，CC+CT vs.TT，CC vs.CT+TT）進行Meta分析，結果表明攜帶C或CC基因的人群與腦卒中的發生風險差異有統計學意義，miR-149 rs2292832基因多態性與腦卒中有相關性，人群中攜帶C或CC基因明顯增加了腦卒中的發生風險。結果見表3，森林圖見圖2。

2.2.2 miR-196a2 rs11614913 對5種遺傳學模型（C vs.T，CC vs.TT，CT vs.TT，CC+CT vs.TT，CC vs.CT+TT）進行Meta分析，結果表明攜帶C或CC基因的人群與腦卒中的發生風險差異無統計學意義，miR-196a2 rs11614913多態性與腦卒中的發生無相關性。結果見表4，森林圖見圖3。

表1 納入研究miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913的基本特征

表2 Meta分析中miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913的基因型分布

表3 miR-149 rs2292832遺傳學模型森林圖結果

圖2 miR-149 rs2292832基因多態性與腦卒中發生風險森林圖

表4 miR-196a2 rs11614913遺傳學模型森林圖結果

圖3 miR-196a2 rs11614913基因多態性與腦卒中發生風險森林圖

2.3發表偏倚和敏感性分析分別對納入文獻進行Meta分析繪制漏斗圖，見圖4～5，漏斗圖基本對稱可能會存在發表偏倚，但發表偏倚較小不影響最終結果。對納入文獻逐一剔除進行敏感性分析，并與排除前的合并效應量進行分析比較，發現效應量無明顯改變，表明此次研究結果穩定可靠。

圖4 miR-149 rs2292832 5種遺傳學模型漏斗圖

圖5 miR-196a2 rs11614913 5種遺傳學模型漏斗圖

3 討論

近年導致腦卒中的疾病呈現多樣性，其中高血壓、糖尿病是熟知的引起腦卒中的最常見疾病。在探討腦卒中的發病機制的臨床研究中，遺傳因素與腦卒中的關聯性研究是目前的研究熱點。動脈粥樣硬化、血脂異常、高血壓以及高同型半胱氨酸血癥等為腦卒中的傳統危險因素。近年流行病學的研究表明遺傳因素中的基因突變增加腦卒中發生風險性的比例逐漸加重〔21〕。近年的研究發現miRNAs作為小分子RNAs，參與了腫瘤、免疫的功能系統、細胞增殖、心血管疾病和神經系統等多種疾病的病理和生理進程，此外miRNAs還能夠調節30%的人類基因表達〔22〕。近年來有關miR-149和miR-196a2基因多態性與腦卒中易感性的研究結果不一致，并且同一種族不同人群、不同地區存在不確定性。為此，本研究就miR-149和miR-196a2基因多態性與亞洲人群腦卒中易感性進行Meta分析，旨在揭示兩種miRNAs基因多態性與腦卒中易感性之間的相關性，為遺傳學上對腦卒中危險因素的分子診治具有重要意義。

當前對miRNAs與腦卒中相關性的研究較多，但研究結果不盡相同。本研究通過Meta分析表明miR-149、miR-196a2中僅有miR-149 rs2292832基因多態性與腦卒中的發生有相關性，人群中攜帶C和CC基因型患腦卒中的風險性明顯增加，而miR-196a2 rs11614913基因多態性與腦卒中的發生無相關性。Xiao等〔23〕的Meta分析中，只納入了兩個研究結果，該研究表明miR-149 rs2292832基因多態性能降低腦卒中發生風險。由于不同的研究者納入研究的樣本量的不同而影響了結果的一致性。本研究共納入了8個研究，通過增加樣本量得到了與Xiao等〔23〕的研究不一致的結論，miR-149 rs2292832基因多態性能增加腦卒中的發生風險。本研究比Xiao等〔23〕的研究結果可信度更高。Xiao等〔23〕的納入研究樣本量過少可能是導致與本研究結果不一致的主要原因。miR-149和miR-196a2的等位基因與腫瘤壞死因子α（TNF-α）、亞甲基四氫葉酸、C反應蛋白（CRP）有密切聯系，并且miR-149能與亞甲基四氫葉酸轉移酶基因的mRNA-3’UTR結合從而調控此基因的表達〔24〕。而亞甲基四氫葉酸轉移酶在編碼甲硫酸-葉酸代謝中起到重要作用，其在人體內具有活性的5-甲基四氫葉酸（5-MTHFR）的 形 成 過 程 中 起 到 促 進 作 用〔25〕。miR-149 rs2292832位點位于miR-149前體序列非成熟結合區內，miR-149-5p的表達受rs2292832位點的影響，其中攜帶CC人群體內miR-149-5p的表達量明顯高于攜帶CT和TT人群的表達量〔26〕。攜帶有miR-149 rs2292832位點基因型CC者體內葉酸水平明顯低于基因型TT攜帶者〔22〕。有研究表明人體內低表達亞甲基四氫葉酸轉移酶可明顯增加腦卒中的發病風險，并且腦卒中患者體內的葉酸水平與健康人群相比明顯降低，而體內葉酸水平較低者通過補充葉酸后腦卒中的發生風險明顯降低〔8，10〕。因此可認為miR-149 rs2292832位點C等位基因和CC基因型通過影響成熟miR-149，調控miR-149與亞甲基四氫葉酸轉移酶基因結合，降低亞甲基四氫葉酸轉移酶基因表達，抑制甲硫酸-葉酸代謝，降低體內5-MTHFR的生成，從而促進腦卒中的發生。體內低5-MTHFR表達可增加血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平，而高Hcy血癥是誘發心腦血管疾病的中度危險因素，它可以造成血管內皮損傷和功能異常，刺激血管平滑肌細胞增生，破壞機體凝血和纖溶系統，影響脂質代謝等，使機體處于血栓前狀態，從而增加了心腦血管疾病發病的危險性〔27〕，通過降低5-MTHFR的生成從而導致血漿Hcy水平增高，促進腦卒中的發生。

本研究納入文獻僅限于中英文符合要求的文獻，研究人群均為亞洲人群，具有較好的地區代表性。該研究對揭示亞洲人群miR-149 rs2292832和miR-196a2 rs11614913基因多態性與腦卒中易感性之間的相關性較為合理、可靠。本研究存在不足是樣本量較為局限，今后希望能通過大樣本、多中心、同質性的病例對照研究，對不同地區的人群進行研究，進一步闡明基因多態性與腦卒中的關聯性。