妊娠期高血壓病中醫(yī)證候與體質(zhì)分布及循環(huán)MicroRNA的研究

熊智慧 王欣晨 官海漣

妊娠期高血壓疾病（Hypertensive disorder of pregnancy，HDP）是妊娠期特有疾病，發(fā)生率為5%～15%［1］。目前其病因和發(fā)病機(jī)制仍未明確，西醫(yī)主要的治療方法是解痙降壓、適時(shí)終止妊娠等對癥治療，但這也是引起圍產(chǎn)兒并發(fā)癥和病死率上升的主要原因［2］。中醫(yī)將整體觀和辨證施治相結(jié)合，從未病先防、既病防傳的中醫(yī)思想入手，在改善妊娠期高血壓疾病患者的妊娠結(jié)局及長期預(yù)后方面有所突破［3］。近年來，關(guān)于MicroRNA與妊娠期高血壓疾病研究也逐漸增多［4-5］。但目前臨床僅有少量研究顯示妊娠期高血壓疾病與中醫(yī)證型、中醫(yī)體質(zhì)分布情況以及相關(guān)MicroRNA的研究。本資料通過長期臨床觀察和總結(jié)，將進(jìn)一步研究其中醫(yī)證候與中醫(yī)體質(zhì)分布情況，并通過明確、量化的科學(xué)手段對妊娠期高血壓疾病證候變化的血液MicroRNA進(jìn)行檢測，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2018年12月在本院產(chǎn)科就診的298例妊娠期高血壓疾病患者以及30例正常妊娠孕婦，對其年齡及孕周匹配。因妊娠期高血壓、子癇前期和子癇與慢性高血壓在發(fā)病機(jī)制及臨床處理上均不同，本研究只納入前三種疾病。即妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，伴有或不伴有24h尿蛋白≥0.3g，或隨機(jī)尿蛋白（+）。所有的參與者均簽署書面知情同意書，并得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)。診斷、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會制定的《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015年）》［6］，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照張玉珍主編的十一五規(guī)劃教材第七版《中醫(yī)婦科》及《中藥新藥治療妊娠期高血壓疾病的臨床研究指導(dǎo)原則》［7］，對妊娠期高血壓疾病進(jìn)行中醫(yī)辨證分型及中醫(yī)癥狀分級量化。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：能夠如實(shí)回答調(diào)查者的問題，在知情同意情況下自愿參與調(diào)查。上述2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)全部符合方可納入。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性高血壓患者；不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；合并有其他內(nèi)外科疾病及妊娠期特有疾病患者。上述3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)有任何1個(gè)或以上符合即可排除。

1.2 方法 主要采用問卷調(diào)查獲得一般資料，中醫(yī)診斷獲得四診信息以及根據(jù)相關(guān)量表判定中醫(yī)證候及體質(zhì)類型，并采用熒光定量qRT-PCR技術(shù)檢測血液中MicroRNA中的表達(dá)，最后統(tǒng)計(jì)分析妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)證候和中醫(yī)體質(zhì)的分布及血液中MicroRNA的表達(dá)情況。（1）中醫(yī)證候評定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中醫(yī)婦科學(xué)》中妊娠期高血壓疾病的中醫(yī)證候分型和近20年有關(guān)中醫(yī)治療妊娠期高血壓疾病的現(xiàn)代文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)，初步將該病分為脾虛濕盛證、腎虛水泛證、脾虛肝旺證、陰虛肝旺證。但在臨床辨證時(shí)調(diào)查者可按中醫(yī)臨床辨證標(biāo)準(zhǔn)，如實(shí)辨證分型并注明具體的辨證分型。經(jīng)由＞3名中醫(yī)專家討論辨證，得出每人的中醫(yī)證候類型。（2）中醫(yī)體質(zhì)判定標(biāo)準(zhǔn)：參照2009年中華中醫(yī)藥學(xué)會制定的中醫(yī)體質(zhì)分類與判定標(biāo)準(zhǔn)，將中醫(yī)體質(zhì)分為平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、瘀血質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)9個(gè)類型，根據(jù)量表5級評分計(jì)算并轉(zhuǎn)化分?jǐn)?shù)。（3）中醫(yī)證型和相關(guān)循環(huán)MicroRNA的測定：①標(biāo)本的采集與保存：患者在入組后次日清晨空腹抽取肘靜脈2ml，置于真空采血管（EDTA-K3抗凝管）中。樣品經(jīng)4℃，3000r/min離心15min，取血漿，每500μl分裝至無核糖核酸的EP管中，-80℃冰箱儲存，用于microRNA檢測。②血清miR-885-5p，miR-26a-5p，miR-155，miR-210的檢測：采用熒光定量qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，具體過程為：依據(jù)miRBASE（http：//www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫4種MicroRNA的序列，設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物；采用Qiagen公司的血清試劑盒，對血漿總RNA進(jìn)行提取；利用NanoDrop2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）測定濃度及OD260/OD280；配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，利用miScriptⅡ Reverse Transcription Kit將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBR GreenI Master試劑盒在Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR檢測。具體過程：配置PCR儀上進(jìn)行熒定量PCR檢測。具體過程：配制PCR反應(yīng)體系；預(yù)變性：95℃10min；高溫變性：95℃下10s；低溫退火與延伸：60℃下30s；高溫變性、低溫退火與延伸進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；從60℃緩慢升溫至97℃，每攝氏度采集5次熒光信號。記錄測定達(dá)成所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值；利用溶解曲線檢測引物的特異性。表達(dá)量的計(jì)算采用 2-△△Ct法。△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組樣品-△Ct對照組樣品，相對表達(dá)量 =2-△△Ct=2-（△Ct實(shí)驗(yàn)組樣品-△Ct對照組樣品）=2-△Ct實(shí)驗(yàn)組樣品/2-△Ct對照組樣品。具體計(jì)算時(shí)以對照組表達(dá)量為1，則比值即為實(shí)驗(yàn)組的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用多元回歸分析、χ2檢驗(yàn)、方差分析等方法進(jìn)行分析與歸納。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較 見表1。

表1 各組臨床資料比較（）

表1 各組臨床資料比較（）

注：與妊娠期高血壓比較，*P＜0.05；與重度子癇前期比較，#P＜0.05；與輕度子癇前期比較，▲P＜0.05

重度子癇前期（n=69）年齡 27.70±2.95* 30.36±4.49# 30.64±5.54# 33.57±4.38▲孕周（周） 37.13±1.11# 38.49±1.30▲ 37.68±1.94# 36.42±1.94*初產(chǎn)婦（n） 25 128 62 46經(jīng)產(chǎn)婦（n） 5 20 19 23單胎（n） 26 145 74 64雙胎（n） 4 3 7 5 SBP（mmHg） 124.92±3.24* 145.60±1.79# 157.17±5.83 158.65±5.01▲DBP（mmHg） 74.99±2.40* 95.72±1.67# 97.95±3.39 98.70±4.70▲尿蛋白（g/24h） 0.05±0.02* 0.18±0.10* 0.85±0.40# 5.50±3.52▲組別 正常組（n=30）妊娠期高血壓（n=148）輕度子癇前期（n=81）

2.2 妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)證候分布情況 見表2。

表2 298例妊娠期高血壓疾病中醫(yī)證型構(gòu)成統(tǒng)計(jì)（n）

2.3 妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)體質(zhì)分布 見表3。

表3 妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)體質(zhì)分布

2.4 妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)證候與體質(zhì)的相關(guān)性分析 見表4。

2.5 正常組及妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)證型循環(huán)MicroRNA表達(dá)的比較 見表5。

3 討論

體質(zhì)是在先天與后天基礎(chǔ)上表現(xiàn)出的機(jī)體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能相對穩(wěn)定的特質(zhì)，代表機(jī)體發(fā)病的內(nèi)環(huán)境。證是機(jī)體正邪交爭的動態(tài)性、階段性的病理概括。體質(zhì)是證的基礎(chǔ)，證是致病因素作用于人體體質(zhì)以后形成的臨床類型。本資料調(diào)查顯示，不同的體質(zhì)證型決定了臨床疾病的嚴(yán)重程度，妊娠期高血壓、輕度子癇前期及重度子癇前期與其體質(zhì)具有顯著差異（P＜0.01），其中以氣虛質(zhì)及陰虛質(zhì)關(guān)系最為密切，妊娠期高血壓在臨床上多表現(xiàn)為脾虛濕盛型和脾虛肝旺型，而輕度子癇前期及重度子癇前期多表現(xiàn)為脾虛肝旺型和陰虛肝旺型，說明不同體質(zhì)差異對妊娠期高血壓疾病的證型影響有明顯差異，并決定了疾病的臨床表現(xiàn)形式。

表4 特定證候類型患者體質(zhì)類型分布［n（%）］

表5 正常組及妊娠期高血壓疾病患者中醫(yī)證型循環(huán)循環(huán)MicroRNA的表達(dá)

先天體質(zhì)是中醫(yī)證型形成的基礎(chǔ)，中醫(yī)證型必然表現(xiàn)各自體質(zhì)的特點(diǎn)，而隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，逐步研究發(fā)現(xiàn)了基因表達(dá)差異會造成許多疾病不同個(gè)體間的差異，中醫(yī)證型可能與基因有密切地聯(lián)系，臨床上證型相同的患者可能存在較為一致的病理改變及相同的基因變異［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA參與了妊娠期高血壓疾病的演進(jìn)，是妊娠期高血壓疾病發(fā)生、發(fā)展的重要分子，其中miR-885-5p，miR-26a-5p，miR-155，miR-210逐步受到關(guān)注［9］。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓疾病患者血液中檢測到的miR-885-5p及miR-26a-5p分別在陰虛肝旺型和脾虛肝旺型表達(dá)中有顯著差異（P＜0.01），而腎虛水泛型患者血液中檢測到的miR-155、miR-210表達(dá)水平顯著高于其他證型組（P＜0.01）。由此可以推斷，證型的出現(xiàn)可能是機(jī)體對不同的分子病理所作出的反應(yīng)，也可能提示妊娠期高血壓疾病發(fā)展過程中證型的轉(zhuǎn)變預(yù)示疾病不同的病理改變，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)脾虛濕盛證型時(shí)，常見為妊娠期高血壓患者，臨床表現(xiàn)主要以血壓的輕度升高為主；而隨著疾病的演變和進(jìn)展，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)脾虛肝旺及陰虛肝旺證型時(shí)，常見為子癇前期患者，臨床表現(xiàn)除了血壓升高外，還伴有機(jī)體其他臟器不同程度的受累，而其內(nèi)在機(jī)制可能與血液中MicroRNA的調(diào)控有關(guān)，提示妊娠期高血壓疾病患者血液中MicroRNA的表達(dá)水平與中醫(yī)證型及中醫(yī)體質(zhì)存在一定的聯(lián)系。

本次調(diào)查在對妊娠期高血壓疾病中醫(yī)證型分布和中醫(yī)體質(zhì)及循環(huán)MicroRNA的探討中，尚缺乏大樣本、多中心的研究調(diào)查，對其辨證分型存在一定主觀因素，同時(shí)，本次調(diào)查只是對臨床上常見的證型進(jìn)行了初步的探討，下一步需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步全面分析中醫(yī)證型和中醫(yī)體質(zhì)及循環(huán)MicroRNA的關(guān)系，揭示中醫(yī)證型的實(shí)質(zhì)和科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)辨證客觀化研究提供依據(jù)。