尿液巨細胞病毒DNA檢測在診斷嬰幼兒巨細胞病毒感染應用中的價值

留靜 付金龍

人 類 巨 細 胞 病 毒（Human cytomegalovirus，HCMV）是引起圍產兒感染最常見的病毒。HCMV侵入人體后可在宿主體內長期持續存在，免疫正常的個體感染HCMV后多無臨床表現，但在免疫機制發育不成熟的胎兒、嬰幼兒和其他免疫抑制個體中可侵襲多個器官、系統而產生嚴重疾病，且人群易感性年齡愈小，易感性愈高，癥狀也愈重［1］。因此，臨床及早診斷和治療對疾病的控制和預后具有重要意義。目前臨床檢測HCMV的方法主要有：血清學特意性抗體檢查、HCMV病毒抗原檢測，病毒學培養檢查、實時熒光定量PCR法等。病毒的分離與培養既耗時、在臨床又難以開展，IgM和IgG抗體的檢測結果在特定情況下也不可靠，而實時熒光定量PCR（FQ-PCR）技術是診斷HCMV感染的快速、有效方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本文為回顧性分析，收集2017年1月至2018年12月間在浙江大學麗水醫院就診的疑似HCMV感染的患兒256例，設為觀察組，其中男155例，女101例；年齡0～3歲。主要臨床癥狀為新生兒高膽紅素血癥、嬰兒肝炎綜合征、肺炎、發熱、嘔吐及腹瀉。并選取同期在醫院體檢的健康嬰幼兒130例設為對照組。

1.2 方法 （1）標本采集和處理：取患兒空腹全血2ml分離膠真空管，顛倒混勻，及時分離血清（離心4000r/min，5min）待檢。不能及時檢測的標本4℃保存，同時留取3ml的小便標本，放4℃冰箱保存，進行HCMV-DNA檢測；為保證檢驗質量，同一批次的標本均于24h內完成檢驗。（2）HCMV DNA測定：嚴格按試劑盒（美國PerkinElmer公司）說明書操作。將50μl處理后的尿液、乳汁、血細胞沉淀物，以及等量DNA提取液加入1.5ml離心管中，100℃加熱10min，12000r/min離心5min取上清液2μl做PCR擴增。FQ-PCR擴增條件（Applied Biosystems 7500 Real time PCR）：93℃，2min預變性；93℃45s→55℃60s，10個循環；93℃30s→55℃45s，30個循環。結果判定由分析處理軟件系統（7500 System software）自動生成。試劑盒檢出限度為103copy/ml。（3）血清標本中HCMV-IgM的檢測：化學發光儀上機檢測：儀器（雅培I2000）及HCMV-IgM試劑由美國雅培公司生產。HCMV-IgM檢測結果以Index值＞1.00為陽性。

1.3 統計分析 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗，計算一致性Kappa系數（Kappa＞0.75表示一致性好，Kappa＜0.4表示一致性差），考察各法檢出結果的一致性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 256例患兒一般情況分析 見表1。

表1 256例不同性別患兒HCMV-IGM、HCMV-DNA檢出率比較［n（%）］

2.2 256例患兒不同年齡組HCMV陽性率比較 見表2。

表2 256例患兒不同年齡組HCMV陽性率比較［n（%）］

2.3 兩種檢測方法的評價 尿液FQ-PCR檢測HCMV-DNA的靈敏度為58.8%（179/306），特異性為96.3%（77/80），準確率為79.21%（306/386），化學發光法血HCMV-IGM的靈敏度為28.3%（46/175），特異性為99.5%（210/211），準確率為45.24%（175/386）。尿液FQ-PCR檢測HCMV-DNA的靈敏度，準確率均高于化學發光法。見表3。

表3 兩種檢測方法的評價

2.4 兩種方法檢測結果比較 入組的256例患兒中，尿液FQ-PCR與化學發光法檢測結果比較，尿液FQPCR陽性率明顯高于化學發光法這2種檢測方法所測結果沒有相關性（χ2=17.652，P＜0.05），Kappa值為0.114，結果缺乏一致性，見表4。

表4 化學發光法與FQ-PCR檢測結果的比較

2.4 HCMV-DNA和血HCMV-IGM尿鑒別小兒巨細胞感染的ROC曲線 見圖1。

圖1 HCMV-DNA和血 HCMV-IGM尿鑒別小兒巨細胞感染的ROC曲線

3 討論

HCMV屬人類皰疹病毒B亞科，為線性雙鏈DNA病毒，原發性感染后會潛伏于人體組織形成終身感染［2］。在機體免疫功能正常的情況下多引起臨床輕微癥狀或無癥狀，但是在免疫功能低下或缺陷的人群，以及免疫功能不成熟或低下的嬰幼兒可引起嚴重疾病，廣泛累及肝臟、肺臟、腎臟、心臟、淋巴細胞等多器官系統，危害巨大［3］。因此，對HCMV的早發現、早診斷、早治療顯得較為重要。

目前臨床檢測HCMV感染的主要標本來源有血、尿、唾液、乳汁、臍帶血等［4］。本資料以患兒血、尿為觀察對象，運用FQ-PCR法檢測尿液標本中HCMV-DNA和化學發光法檢測患兒血里面的HCMVIgM，結果提示FQ-PCR檢測法檢出率顯著高于化學發光法，差異有統計學意義（χ2=17.652，P＜0.05），由于在HCMV感染早期，機體剛開始產生的IgM時，血循環內只有微量的病毒顆粒，并未達到檢測標本含有HCMV的IgM［5］，但是此時體內病毒顆粒復制最為活躍同時隨腎臟大量排出［6］，尿液DNA可檢測。隨著機體免疫應答增強至抗體IgG大量產生后，體內病毒顆粒復制和排出緩慢下降，但是仍可持續通過腎臟排出［7］。但是由于腎小管為間歇排HCMV可能存在漏檢，因此臨床常檢測血液HCMV-IgM，方便監測HCMV的感染情況，而尿液DNA檢測有利于確診。本資料在對觀察對象的血液HCMV-IgM和FQ-PCR HCMV DNA發現其陽性率分別為17.96%和69.9%，Kappa值為0.114，兩者結果缺乏一致性。而且尿液留取方便，對于小月齡的患兒檢測尿液HCMV DNA對于HCMV感染及治療效果監測更容易，更易讓家長接受。

本資料對比各年齡段患兒發現，28d～1歲的患兒數量居多，檢出的陽性率也偏高，尤其是尿液DNA檢測陽性率達76.59%，對比其他年齡段差異有統計學意義（P＜0.05）。新生兒巨細胞感染途徑有三個：一個是孕婦子宮內感染；一個是分娩時的經產道感染；第三個是出生后的感染，前兩種臨床最多見，而新生兒出生后隨著病毒量不斷拷貝，臨床癥狀也隨之相應出現，所以28d～1歲之間感染的患兒檢測人數增加，檢出率也高于其他年齡段（P＜0.05）。

綜上所述，在抗HCMV治療的療效監測中，不能僅檢測HCMV-IgM抗體的滴度，還應特別注意尿HCMV-DNA的監測，其對于臨床隨診觀察療效的幼兒不僅取材更方便而且更具有臨床指導意義。