牡丹芍藥組間遠緣雜交胚珠拯救研究

賀 丹,鄭云冰,何松林*,解夢珺,蘇曉迪,王 政,劉藝平

1.河南農業大學 林學院,河南 鄭州 450002

2.河南科技學院,河南 新鄉 453000

牡丹（Paeonia suffruticosa）和芍藥（Paeonia lactiflora）均為芍藥科芍藥屬（Paeonia）植物，著名觀賞、藥用花卉，深受人們的喜愛，具有極高的園林觀賞價值和重要的經濟價值[1]。雜交育種作為提高植物觀賞價值、培育園藝新品種的主要途徑[2-4]，在牡丹、芍藥間的應用已有百年歷史[5]。通過雜交育種，已經選育出了一系列觀賞價值高、抗寒、抗病的新品種[6]，但是牡丹芍藥間的遠緣雜交育種工作依然存在問題，二者雜交育種周期長，培育新品主要表現為受精前障礙與雜種敗育等問題。在多組牡丹與芍藥間遠緣雜交育種試驗中，均發現了存在受精前障礙，嚴重影響雜交結實率，并發現不親和性主要是不親和的花粉導致花粉管生長難度高。其關鍵原因是物種之間在長期的進化中形成了生殖隔離，常表現出雜交不親和性，柱頭組織中產生大量的胼胝質沉積，從而阻礙了花粉管的生長[7-9]。為克服花粉與柱頭之間的不親和性，一般在授粉后，通常采用遠緣雜交育種與胚珠培養相結合的方法來獲得幼苗[10]。

胚珠培養技術對獲得優良的雜種后代具有重要作用，獼猴桃種間遠緣雜交利用胚珠培養獲得了雜交后代并初步探討了不同培養基類型對其發育的影響，獲得了以狗棗獼猴桃為親本的遠緣雜交后代，豐富了獼猴桃遠緣雜交的胚挽救體系，為培育出更多獼猴桃新種質創造了條件[11]。桔梗的自花授粉結實率低，對經花藥得到純合二倍體的未受精胚珠進行組織培養，得到桔梗單倍體植株，為桔梗的遺傳研究和育種實踐提供了豐富的自交系材料[12]。隨著對非洲菊未受精胚珠離體誘導條件進行優化，非洲菊未受精胚珠離體誘導植株高頻再生體系逐漸完善，避免了供體材料選擇的盲目性，為高效誘導非洲菊單倍體植株，快速構建DH 群體和選育優質新品種奠定基礎[13-16]。

本試驗選取性狀優良的牡丹芍藥遠緣雜交系種子進行胚珠培養，建立胚珠培養體系，旨在研究胚珠離體萌發中的影響因素。本實驗室通過大量組織切片，發現只是在授粉后9～10 d 能觀察到少量正常球型胚，但之后胚體就開始異常降解，選擇人工授粉后第9 d～15 d 的胚珠，設置不同濃度NAA、IBA 處理的初代培養基，在常規培養條件下初代培養后轉入不同濃度GA3、IBA 處理的繼代培養基上繼續培養。確定適宜的培養基進行試驗，摸索出培養的最適胚齡以及培養基類型，為胚珠培養技術輔助遠緣雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交親本材料選自河南農業大學第三試驗田，長勢均等良好、無病蟲害的牡丹品種‘鳳丹白’（Paeonia ostii‘Feng dan bai’）、芍藥品種‘粉玉奴’（Paeonia lactiflora‘Fen yu nu’）。以正交‘粉玉奴’ב鳳丹白’、反交‘鳳丹白’ב粉玉奴’兩個雜交組合的胚珠作為供試材料。

1.2 試驗方法

采用胚齡分別為人工授粉后9 d，10 d，11 d，12 d，13 d，14 d，15 d 的兩個雜交組合的胚珠作為外植體，將滅菌消毒后的試驗材料在無菌條件下沿種莢腹背線剖開，取出整排胚珠，迅速接種于預先配置的啟動培養基上（表1）。將其先放置于培養室中（溫度24±1 ℃）進行黑暗培養2 周，隨后轉至常規培養條件（溫度24±1 ℃，光強2000 LX，光照時間12 h·d-1）下進行初代培養，定期觀察培養物污染、褐化、胚珠膨大等萌發表現，培養30 d 后統計各項指標。

把經過初代培養的試管胚珠轉入繼代培養基上（表2），在常規培養條件（溫度24±1 ℃，光強2000 LX，光照時間12 h·d-1）下進行培養，定期觀察胚的萌發發育情況。

表1 啟動培養基及激素組合Table 1 Initial medium and hormone combination

表2 繼代培養基及激素組合Table 2 Subculture medium and hormone combination

2 結果與分析

2.1 胚齡對胚珠萌發的影響

2.1.1 胚齡對正交胚珠培養萌發的影響 如圖1、表3 所示，不同發育時期的胚珠在啟動培養過程中的表現不同。胚齡9～15 d 的胚珠在初代培養時，前期（≤20 d）胚珠保持乳白色，少量胚珠增大。培養45 d 時，胚齡9 d 的胚珠大部分轉綠并膨大，褐化少，少數出現畸形生長現象；胚齡10 d 的胚珠開始轉綠并膨大，胚珠死亡數少。培養65 d 時，齡期9 d～14 d 的胚珠部分開始死亡；胚齡15 d 的存活胚珠仍為白色。培養80 d 時，9～11 d 的胚珠顏色轉為深綠，并出現假死現象；齡期14 d，15 d 的胚珠大部分褐化死亡，個別生長極緩慢，培養15 d 后死亡。[A]培養45 d 時，胚齡9 d 的胚珠大部分轉綠并膨大，褐化少，其中少數出現畸形萌發現象；[B]胚齡10 d 的胚珠開始轉綠并膨大，胚珠死亡數少；[C]胚齡11 d 的胚珠可能由于滅菌不徹底導致污染率較高，且大部分為白色；[D]胚齡13 d 的胚珠褐化程度較高，少部分轉綠，并在培養90 d 時全部褐化死亡；[E]胚齡14 d 的胚珠部分仍為乳白色，少數轉綠且萌發緩慢；[F]胚齡15 d 的胚珠多數褐化死亡，多數皆為乳白色且萌發緩慢。

圖1 正交胚珠培養Fig.1 Orthogonal ovule culture

表3 不同發育時期的正交胚珠在培養中的萌發表現Table 3 Germination of orthogonal ovule at different developmental stages in culture

圖2 不同胚齡對正交胚珠萌發的影響Fig.2 Effect of different embryo ages on the germination of orthogonal ovule

在整個培養過程中，胚齡9 d 的胚珠膨大率、存活率最高，褐化率、污染率與畸形膨大率最低，其次為胚齡10 d 的胚珠。綜上認為齡期9 d，10 d 的胚珠可以用來做前期培養（圖2）。

2.1.2 胚齡對反交胚珠培養萌發的影響 從圖3、表4 可以看到，胚齡9～15 d 的胚珠在培養前期（≤8 d）為乳白色，無明顯增大。培養20 d 時，胚珠開始膨大。40 d 時，胚齡9～10 d 的胚珠開始變綠，12～15 d 的胚珠已全部轉綠。培養60 d 時，胚齡9～11 d 的胚珠部分緩慢膨大；胚齡12～13 d 的胚珠大部分膨大迅速，試驗中剖開一部分發現胚乳中央存在空腔，未觀察到種胚。培養90 d 時，胚齡9 d、11 d的胚珠大部分萎焉死亡，少數綠色胚珠生長緩慢；胚齡10 d 的胚珠少數出現玻璃化、畸形生長；胚齡12 d 的胚珠大量萎焉死亡，少數生長緩慢；胚齡13 d 的胚珠死亡數少，玻璃化程度高；胚齡14～15 d 的胚珠極少數綠色胚珠生長緩慢。

由表4 可知，胚齡為11 d，12 d，13 d 的胚珠存活率、胚珠膨大率、胚珠死亡率高，污染率、畸形膨大率低，萌發情況相對較好，可以用來做前期培養。

圖3 反交胚珠培養Fig.3 Reciprocal cross ovule culture

[A]胚齡9～15 d 的胚珠在培養前期（≤8 d）為乳白色，不增大；[B]40 d 時，胚齡9～10 d 的胚珠開始變綠；[C]胚齡12～15 d 的胚珠轉為淺綠色，開始膨大；[D]培養60 d 時，胚齡9 d 的胚珠部分膨大，少數萎焉死亡；[E]胚齡10～11 d 的胚珠少部分膨大較快；[F]胚齡12～13 d 的胚珠大部分膨大迅速；[G]胚齡14 d 的胚珠大部分萎焉死亡，少部分繼續膨大；[H]胚齡15 d 的胚珠一半萎焉死亡，試驗中剖開一部分發現胚乳中央存在空腔，未觀察到種胚。

表4 不同發育時期的反交胚珠在培養中的萌發表現Table 4 Germination of reciprocal cross ovule at different developmental stages in culture

2.2 不同培養基對正、反交胚珠萌發的影響

2.2.1 不同初代培養基對正交胚珠萌發的影響 經過45 d 的培養，從圖5 可以看出在9 種培養基中，在褐化程度上各組數據普遍偏高，在9 種培養基中，處理2 的存活率最高，其次為處理1，處理4；處理6 的畸形膨大率最低，其次為處理4，處理1；處理5 的污染率最低，其次為處理6，處理9；處理6 的胚珠膨大率最高，為90.32%，其次為處理4，處理5；在褐化程度上普遍偏高，其中處理4最低，其次為處理2，處理1。處理4 和處理6 培養基的存活率高、畸形膨大率低、污染率低、胚珠膨大率高，最適于對胚珠萌發啟動生長。

圖4 不同胚齡對反交胚珠萌發的影響Fig.4 Effect of different embryo ages on the germination of reciprocal cross ovules

圖5 不同培養基對正交胚珠萌發的影響Fig.5 Effect of different culture medium on germination of orthogonal ovule

2.2.2 不同初代培養基對反交胚珠前期萌發的影響 經過60 d 的培養，從圖6 中可見，排名在前三位的胚珠畸形膨大率由低到高依次為處理5，處理4，處理6；污染率由低到高分別為處理1，處理5，處理8；存活率由高到低分別為處理5，處理3，處理4；胚珠膨大率由高到低依次為處理4，處理6，處理5；胚珠死亡率由低到高依次為處理3，處理4，處理5。處理4、5 胚珠畸形膨大率低、污染率低、存活率高、胚珠膨大率高且胚珠死亡率低，作為胚珠初代萌發培養基較為合適。

圖6 不同培養基對反交胚珠前期萌發的影響Fig.6 Effects of different culture medium on the early germination of reciprocal cross ovules

2.2.3 不同繼代培養基對正、反交胚珠繼代萌發的影響 正交培養結果表明（表5），發育早期（≤15d）的胚珠繼代培養不成功，雖然處理1 中胚珠的褐化程度較其他處理輕，存活時間也較長，部分胚珠顏色轉綠，體積也略有增大，但在繼代后35 d 內胚珠逐漸增長緩慢且最終也逐漸變黑死亡。

反交胚珠繼代培養結果如圖7 所示，培養30 d 后，在4 種培養基中，雖然處理4 在反交胚珠繼代培養中胚珠膨大率與生存率相對于其他處理較高，但是在繼代后期胚珠逐漸停止萌發，且大量皺縮直至全部變白死亡。

表5 不同培養基對正交胚珠繼代萌發的影響Table 5 Effect of different culture medium on transgenerational germination of orthogonal ovule

圖7 不同培養基對反交胚珠繼代萌發的影響Fig.7 Effect of different culture medium on transgenerational germination of reciprocal cross ovules

3 討論

3.1 不同胚齡對正反交胚珠的影響

本試驗通過對牡丹芍藥遠緣雜交敗育前的胚珠進行培養，選擇不同胚齡的胚珠，使用不同類型的培養基進行培養，試驗結果表明，胚珠的胚齡明顯影響離體培養效果，雖然齡期9 d，10 d 的胚珠膨大率較高，存活時間相對較長，但在培養65 d 后相繼變黑死亡。年幼胚珠培養不成功的原因可能是胚珠內部種胚還處于游離核或細胞化時期，或種胚已經完成細胞化，處于胚原基發生階段，異養時期，不具備某種合成能力，還需要從胚乳中吸取足夠的營養物質。幼胚敗育時間越早，幼胚越小，發育早期種胚未完成器官分化的胚珠所需的環境以及營養成分也就越復雜[17]。齡期11 d、12 d、13 d的反交胚珠在初期培養過程中萌發迅速，培養60 d 時全部轉綠且膨大率相對較高，但其與正交情況相似，也在轉綠后40 d 內逐漸停止萌發，最后由綠變白死亡。此結果與何桂梅對牡丹雜交胚珠、Batygina[18]在塊根芍藥及珊瑚芍藥中的研究基本相似。胚齡是影響胚挽救的一個重要因素，胚發育早期所需的物質較為復雜[19]。試驗中不同胚齡胚珠的發育狀況各不相同，表明胚齡的選擇直接關系到胚珠培養的成功，若想通過胚珠培養實現牡丹、芍藥雜交成苗，加速育種進程，選擇合適胚齡胚珠是遠緣雜交中防止早期胚敗育并獲得遠緣雜種后代的一個重要途徑。

3.2 不同培養基對正反交胚珠萌發的影響

胚珠培養是在無菌條件下對外植體胚進行解剖后培養,由于胚體積比較小,操作比較困難,很容易損傷胚體,從而影響胚離體培養萌發與成苗率[20]。本試驗對反交子房進行切半處理,胚珠較易剝離，可以獲得較為完整的外植體。

胚珠培養過程中受多種因素的制約，培養基是影響胚珠正常萌發的重要因素之一。本試驗對正交胚珠初代培養45 d 后發現，培養基MS+NAA0.5 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1或IBA0.5 mg·L-1胚珠萌發的各項指標相對較好；反交胚珠初代培養60 d 后發現，培養基MS+NAA0.5 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1或IBA1.0 mg·L-1胚珠萌發的各項指標相對較高。高污染率與褐化率是牡丹、芍藥組織培養中的普遍現象[21]，在正交培養過程中發現，胚珠褐化程度普遍較高，此結果與何桂梅等[22]的研究結果基本一致。其原因之一可能是滅菌時間過長產生了毒害作用，其二可能是胚珠自身含有酚類物質，在培養過程中易發生氧化作用而導致胚珠褐化。因此，試驗后認為，胚珠離體培養時應盡量采用直接消毒方式，采用更強的消毒劑。為降低褐化程度，使胚珠在隨后的繼代培養中正常萌發，在培養基中還應加入一些其它物質來防止胚珠褐化。

在繼代培養中，無論是正交還是反交胚珠，都在培養80 d 后時開始停止萌發并逐漸死亡。其原因可能是發育中后期的胚珠未完成器官分化或正處于器官分化狀態，萌發所需的離體培養基條件比較復雜，如培養基中的激素類型、濃度配比等還需進一步的探索。綜合雜交與胚珠培養的結果認為，胚珠繼代培養對胚珠后期萌發至關重要，雖然目前胚珠培育成苗還需優選培養基及優化操作程序，但該技術對育種周期較長的牡丹芍藥遠緣育種有較大的應用潛力，值得深入研究。但在雜交育種工作中仍有諸多問題尚未解決，如幼胚繼代培養、雜交種褐化嚴重問題都大大影響了育種工作的效率。因此，在以后的工作中，應著重從繼代培養基的篩選、激素組合、減輕褐化等方面進行雜種胚挽救的研究，為今后牡丹的育種工作開辟新的方向。