棗癭蚊微衛星標記篩選及微衛星多態性分析

馬光皇 ,康淑媛 ,李 莉 ,肖海兵,3 ,熊仁次 ,楊明祿,3

(1.塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.農業部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】棗癭蚊 (DasineurajujubifoliaJiao & Bu，2016)，屬雙翅目(Diptera)癭蚊科(Cecidomyiidae)棗癭蚊[1]。別稱棗芽蛆、棗葉癭蚊，主要寄主有紅棗樹和酸棗樹。該蟲分布范圍較廣，在新疆、山東、浙江、陜西等各地棗產區均有出現[2-4]。研究種群遺傳結構分析害蟲的擴散途徑、抗性標記等，對其研究害蟲成災機制和綜合防控技術有重要意義。【前人研究進展】棗癭蚊每年發生3～6代，其中發生最多和危害最嚴重的是第1代和第2代[5]。棗癭蚊體態較小，蟲體長1～2 mm，體色橙紅紅或灰褐，念珠狀觸角，黑色復眼；卵長橢圓形，長0.2 mm左右，近似透明，剛生產時卵為白色，后逐漸變為紅色，且有光澤；幼蟲似蛆，有3個齡期；蛹黃褐色，長1～2 mm；繭為橢圓形，灰黃色，長1～2 mm[6]。棗癭蚊越冬由最后一代老熟幼蟲在淺土層化繭完成，越冬成蟲于4月開始危害棗樹嫩葉，使葉片從葉邊緣開始卷曲且呈筒狀，葉片從綠色變為紅色，后期變為黑色并脫落[7]。棗癭蚊常危害主枝頂芽，在受災嚴重區域，棗樹被害率高達100%，嚴重影響棗的產量和品質[8]。目前，針對棗癭蚊防治多為化學方法[9-11]，以黃板誘殺作為輔助性措施，以減少棗園被危害程度。目前隨著微衛星標記應用的逐漸成熟與完善，利用微衛星標記研究種群遺傳已成為常態。種群遺傳結構研究方法包含隨機擴增多態性DAN、擴增片段長度多態性和微衛星標記等，其中微衛星(Microsatellties)因重復性好、使用方便而備受推崇。微衛星又稱簡單重復序列(Simple sequence repeat,SSR),序列的重復數是高度的，在基因組中通常以1～6個短核苷酸串聯的形式出現，組合成幾十個到上百個核苷酸的重復序列[12-13]，微衛星較基因組DNA中的其他區域具有更高的突變率，且微衛星序列相鄰的兩側區域保守性較高，通過PCR技術和凝膠電泳檢測技術可方便檢測其位點多態性[14]。因微衛星在個體或種群之間都具有較強的多態性，廣泛應用于生物遺傳多樣性和基因定位等研究中[15-16]。【本研究切入點】棗癭蚊的微衛星研究未見報道。研究棗癭蚊基因遺傳變異程度，分析基因多態性。【擬解決的關鍵問題】棗癭蚊基因組數據庫搜索SSR，來設計SSR引物進行多態性篩選。為棗癭蚊種群遺傳結構研究等提供支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品

在阿拉爾市(塔里木大學周邊)、昆玉市(79°18′39.871″，37°14′45.800″)、且末縣(85°30′19.298″,38°13′43.780″)，每地分散采集有幼蟲棗葉，用于基因組DNA提取。

1.1.2 試劑及儀器

通用型柱式基因組提取試劑盒、Taq酶和DM2000 maker(康為世紀)；無水乙醇(天津致遠化學試劑有限公司)、瓊脂糖(BIOWEST)等。

基因擴增儀(BSW-6T-II上海啟步生物科技有限公司)；紫外凝膠成像儀(Gel Doc XR+ 上海旦鼎國際貿易有限公司)；高速離心機(PICO21 Thermo Fisher)；高通量組織研磨器(SCIENTZ-48寧波新芝生物科技股份有限公司)；電泳儀(DYCP-32B北京六一生物科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(DK-80上海精宏實驗設備有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 棗癭蚊DNA提取及質量檢測

按照通用型柱式基因組提取試劑盒提取棗癭蚊DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳檢測，以微量核酸檢測儀檢測DNA濃度與OD260/280比值。

1.2.2 微衛星引物設計

以棗癭蚊基因組DNA為模板，分別對所隨機選取的48對微衛星引物進行PCR擴增，以MISA檢測棗癭蚊特定基因組序列中的SSR[17]，參數設置為SSR最小間距為200 bp，1～6核苷酸最少重復次數分別為10、6、5、5、5、5。以Primer3設計SSR上下游引物，從中挑選出48對引物交由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反應體系

20 μL反應體系：10×PCR buffer 2 μL；dNTP 0.4 μL；Taqpolymerase 0.1 μL；DNA1 μL；F引物0.8 μL、R引物0.8 μL；ddH2O 14.9 μL。

1.2.4 PCR反應條件

94℃預變性3 min；94℃變性30s，退火50℃(或54或58℃)30s，延伸72℃ 20s，進行34個循環；終延伸72℃ 5 min，4℃保存。

1.2.5 PCR產物凝膠檢測

用2%瓊脂糖凝膠進行PCR產物電泳檢測，初步篩選出穩定擴增的引物。

1.2.6 微衛星多態性檢測

按Fragment Analyzer及其試劑盒要求進行毛細管電泳檢測，PROSize2.0片段分析軟件分析電泳結果，人工校對后將PCR產物長度記錄于Excel表中。

1.3 數據處理

利用Excel軟件整理電泳數據，并轉換成Cervus(3.0)軟件輸入的文本格式，由Cervus計算微衛星的等位基因數(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態信息含量(PIC)等。

2 結果與分析

2.1 核酸檢測

研究表明,阿拉爾市、昆玉市和且末縣樣品各20只，提取棗癭蚊DNA，凝膠電泳檢測發現條帶單一且明亮，無拖尾。棗癭蚊基因組DNA的OD260/280值均在1.4～2.0，DNA濃度在20～40 ng/μL。圖1

注：第1泳道至第4泳道分別對應昆玉市1～4號棗癭蚊樣品
Note:Lanes 1 to 4 correspond to samples ofDasineurajujubifoliain Kun Yu City 1-4 respectively

圖1 昆玉市部分棗癭蚊樣品基因組DNA提取瓊脂糖電泳
Fig.1 Genomic DNA extraction and agarose electrophoresis ofDasineurajujubifoliasamples in Kun Yu

2.2 PCR引物篩選

以棗癭蚊基因組DNA為模板，分別對所隨機選取的48對微衛星引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發現42對能擴增出條帶，剔除擴增片段大小與預測不一致和擴增不理想的引物，發現有20對引物能穩定、清晰的擴增出條帶，可進行后續SSR多態性篩選。表1,圖2

表1 篩選的棗癭蚊20對SSR引物信息Table 1 Information of 20 pairs of SSR primer from Dasineura jujubifolia

注：使用阿拉爾1號DNA,1～24泳道分別對應Dj01～Dj24號引物電泳結果
Note:Using Alar No.1 DNA,lanes 1-24 correspond to the results of the electrophoresis of the Dj01-Dj24 primer

圖2 棗癭蚊部分SSR引物PCR瓊脂糖電泳
Fig.2 The part result of PCR agarose electrophoresis ofDasineurajujubifolia

2.3 微衛星多態性

研究表明,擴增產物經毛細管電泳檢測發現條帶清晰，片段長度在預測范圍內，經人工比對后將檢測到片段大小數據導入Excel。經Cervus軟件計算20個微衛星位點共擴增出112個等位基因，平均每個位點擴增出5.6個等位基因，等位基因數(Na)在3～9，其中Dj-33擴增出9個等位基因；微衛星位點的觀測雜合度(Ho)在0.120～0.680，期望雜合度(He)在0.549～0.847，多態信息含量(PIC)在0.456～0.815；處理得其中Ho、He、PIC平均值分別是0.358、0.694和0.635；其中PIC值小于0.50的有Dj-13、Dj-20；其他特異性引物PIC值也大于0.50，引物多態性較高，可用于棗癭蚊的遺傳多樣性或種群遺傳結構等方面的研究。圖3,表2

表2 引物在棗癭蚊個體的多態性驗證Table 2 Verification of the Polymorphism of the Primers in Dasineura jujubifolia

注：使用若羌5號DNA,A1～A11分別對應Dj01～Dj11號引物毛細管電泳結果
Note:Using Ruo Qiang No.5 DNA,A1-A11 correspond to Dj01-Dj11 primer capillary electrophoresis results

圖3 若羌Dj01～Dj11引物在個體毛細管電泳結果
Fig.3 The result of Ruoqiang Dj01-Dj11 primer in capillary electrophoresis

3 討 論

微衛星在生物個體間呈現高度變異性，在基因組中基因型豐富，因此,微衛星標記廣泛應用于系統發育、遺傳結構和遺傳多樣性研究領域[18]。近年來，已有研究者利用微衛星標記來達到研究種群遺傳結構的目的，但是棗癭蚊的種群遺傳結構研究較少，棗癭蚊微衛星標記開發為其種群遺傳結構等研究提供了支持。

多態信息含量(PIC)是衡量微衛星位點群體多態性的重要指標之一,可以反映出群體的遺傳變異程度[19]，一般認為：當PIC>0.50時，代表位點具有高度多態性，當0.25

但研究采樣存在覆蓋范圍較小的局限，對棗癭蚊種群遺傳多樣性分析也是探索性的，今后應對全疆乃至全國進行采樣，研究棗癭蚊快速擴散后的種群遺傳多樣性與遺傳結構特征。

4 結 論

開發了棗癭蚊微衛星標記，篩選出20個微衛星位點，其觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態信息含量(PIC)平均值分別是0.358、0.649和0.635，其中得到18個理想的微衛星位點，其PIC值>0.5，具有較高的多態性，可用于棗癭蚊種群遺傳多樣性及遺傳結構研究。