混菌發酵生產芒果醋條件優化及其產品質量評價

張開平1,劉燕麗1,黃江奇2,農建鵬1,周利宏1,吳文標

(1.百色學院農業與食品工程學院,廣西百色 533000; 2.龍邦海關,廣西靖西 533800; 3.西南大學食品科學學院,重慶 400716)

醋的流行源于其具有調節高血脂的作用[1]。此外,有大量的研究表明食醋還具有其它一些保健作用如:緩解靜脈曲張[2]、降血糖[3-7]、抗氧化作用、改善非酒精型脂肪肝患者的生育力[8]和減輕高脂飲食導致的肝損傷[9]等。

芒果(MangiferaindicaL.)屬于仙人掌漆樹科杧果屬,富含各種維生素和人體必需礦物質元素,俗稱“熱帶水果之王”[10-11]。隨著現代農業的高速發展以及國家政策對農業的大力支持,芒果種植面積大幅增加,產量逐年升高,因此,其資源十分豐富[12-13]。但是,我國對于芒果的加工程度仍然不高,造成了較大的資源浪費,不能發揮其優勢創造良好的經濟效益[14-15]。以芒果為原料釀制成果醋,不僅具有芒果固有的果香,而且還具有比芒果更高的營養價值,芒果經發酵制成芒果醋后,其總抗氧化能力(FRAP法測定)為(4.8±0.5) mmol·L-1,較芒果果實高,同時還能增加芒果醋中揮發性脂肪酸含量,賦予芒果醋特殊風味[16-17]。

混菌發酵是指利用兩種或兩種以上具有共生作用的微生物,聯合完成某種發酵過程的新型技術,是單一菌株純培養技術上的創新,目前混菌發酵主要研究熱點在于酵母-乳酸菌、酵母-醋酸菌的混合發酵。Wang等采用釀酒酵母與巴氏醋桿菌混合發酵,并對發酵工藝進行正交優化,結果發現混菌發酵能減少發酵損失,提高產酸率,混菌發酵產酸率為66.0 g/L,比對照組提高約50%[18]。Nguyen等[19]采用酵母菌-醋酸菌混菌發酵葡萄糖醛酸,酵母菌(23×108CFU·mL-1)與醋酸菌(2×108CFU/mL)最佳初始組合比例為4∶6,該比例下葡萄糖醛酸產量為175.8 mg·L-1,發酵周期7 d,顯著提高了生產效率(P<0.05)。我國民間傳統紅茶菌發酵飲料一般都是由幾種醋酸菌與酵母菌共同發酵而成,其中,醋酸菌和酵母菌共生,酵母菌是“啟動子”,酵母菌分解蔗糖,供自身繁殖并生成乙醇;醋酸菌利用酵母分解蔗糖獲得碳源,酵母產生的乙醇會刺激醋酸菌產生乙酸,而乙酸又能刺激酵母菌產生乙醇;此外,不同醋酸菌、酵母菌菌種發酵紅茶,由于菌種差異性和代謝途徑的復雜性,所形成的發酵產物的風味物質、活性成分數量和含量也有所差異[20-22]。由此可見,與傳統的純種分段發酵相比,混菌發酵中的多種微生物之間形成特殊的共生關系及復雜代謝通路,使得發酵過程得以縮短,簡化工藝,提高生產效率,還可改進傳統發酵產品風味欠佳的缺點[23]。雖然近幾年在采用其它原料混菌發酵生產食醋方面有研究報道,例如王陶等[24]開展了以紫薯和杏鮑菇為原料,經果酒酵母和醋桿菌混合發酵生產復合醋方面的研究,但混菌發酵應用于生產芒果醋目前鮮見報道。

本研究以百色市芒果為原料,對采用酵母菌醋酸菌混菌發酵生產芒果醋的條件進行優化,并對生產的芒果醋的質量進行了評價,旨在為芒果的進一步深加工利用提供有效的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果 購于百色市芒果街水果批發市場;酵母菌 安琪葡萄酒果酒專用酵母粉(SY10 g);醋酸菌SS-019 實驗室保藏;果膠酶(30萬 U/g) 泰安信得利生物工程有限公司;白砂糖(一級品) 柳冰食品廠;異抗壞血酸鈉(食品級) 河南康之旺生物科技有限公司;其它試劑 均為分析純。

LRH-70型生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;FAI2048型電子分析天平 上海市安享電子儀器廠;HH-S1型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器有限公司;HYG-B型全溫搖瓶柜 江蘇常州金壇良友儀器有限公司;JYL-Y917型榨汁機 九陽股份有限公司;手持折光儀 上海勃基儀器儀表有限公司;GJJ-0.03/100型高壓均質機 上海諾尼輕工機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 醋酸菌活化培養基(g/L):酵母膏12.0,葡萄糖12.0,碳酸鈣15.0,瓊脂18.0,pH5.5,培養基滅菌后,加入5%經過濾除菌的無水乙醇。

醋酸菌種子培養基(g/L):酵母膏12.0,葡萄糖12.0,pH5.5,培養基滅菌后,加入5%經過濾除菌的無水乙醇。

1.2.2 芒果醋釀制工藝流程 在Kaushik等[25]所報道的制取芒果漿工藝流程基礎上加以改進制作出芒果汁;然后發酵芒果汁生產芒果醋。整個試驗過程中具體的操作流程如下:

1.2.3 芒果醋釀制工藝的操作要點 芒果汁的制備:挑選芒果表皮光滑且果皮皮色黃橙,無機械損傷、無病蟲害的新鮮芒果,洗凈之后放入90 ℃的熱水浴中燙3 min,剝皮切塊、打漿,加0.01%異抗壞血酸鈉防止果汁發生酶促褐變[26],然后再加0.1%果膠酶于55 ℃的恒溫水浴鍋中酶解1.5 h,用四層無菌紗布過濾,得芒果汁備用。

調整芒果汁糖度與酸度:取少量芒果汁先溶解白砂糖,然后加入芒果汁中,調整芒果汁糖度到發酵用糖度,再添加適量的檸檬酸調整果汁酸度到pH5.0。

滅菌:將調配糖度和酸度后的芒果汁放入熱水浴中進行殺菌滅酶,待果汁中心溫度達到80 ℃時,繼續保溫8 min,保溫時間結束后,立即冷卻至28～30 ℃,備用。

菌種活化:酵母菌活化種子液:按照10 g酵母粉加100 mL 5%糖濃度的芒果汁的比例,稱取所需酵母于38 ℃條件下攪拌,活化約15～20 min,出現大量小氣泡即可[27],備用。醋酸菌活化種子液:將保藏菌種進行平板劃線培養,然后將活化的醋酸菌接入種子培養基中,于30 ℃、130 r/min的恒溫搖瓶柜培養36 h[24],備用。

果醋釀造:將50 mL調配糖度和酸度后的芒果汁裝入經過高溫滅菌的三角瓶中,分別接入一定量的酵母菌與醋酸菌種子液,然后分別放置在一定的溫度條件下,于130 r/min的恒溫搖瓶柜分別培養6～11 d。發酵期間每天測定醋酸含量,直到醋酸含量不再上升或上升緩慢時即可停止發酵。發酵原果醋經過陳釀、過濾、均質、殺菌、無菌裝瓶等工序,即得芒果醋成品。

1.2.4 混菌發酵單因素實驗

1.2.4.1 芒果汁初始糖度對混菌發酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,調節芒果汁初始糖度分別為10、12、14、16、18和20 °Bx,其它固定因素如下:酵母菌接種量0.15%,醋酸菌接種量8%,發酵溫度30 ℃,發酵時間7 d,發酵結束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.2 酵母菌接種量對混菌發酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,酵母菌接種量分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.20%、0.25%(v/v),其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,醋酸菌接種量8%,發酵溫度30 ℃,發酵時間7 d,發酵結束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.3 醋酸菌接種量對混菌發酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,醋酸菌接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%(v/v),其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,酵母菌接種量0.15%,發酵溫度30 ℃,發酵時間7 d,發酵結束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.4 發酵溫度對混菌發酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,將發酵溫度分別設置為26、28、30、32、34、36 ℃,其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,酵母菌接種量0.15%,醋酸菌接種量8%,發酵時間7 d,發酵結束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.5 發酵時間對混菌發酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,發酵時間分別為6、7、8、9、10、11 d,其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,酵母菌接種量0.15%,醋酸菌接種量8%,發酵溫度30 ℃,發酵結束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.5 正交試驗 為了確定混菌發酵芒果醋的最優條件,以發酵結束時果醋中乙酸含量為指標,根據單因素實驗的結果分析,固定酵母菌添加量為0.15%(v/v)、恒溫搖瓶柜的轉速為130 r/min,選取芒果汁初始糖度、醋酸菌添加量、發酵溫度和發酵時間4個因素進行L9(34)正交實驗,因素與水平見表1。按照“1.2.3”所述的基本步驟進行了各種組合試驗。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 芒果醋指標的測定 總糖:DNS法,準確量取適量待測液,加入DNS試劑并沸水浴5 min后定容,在520 nm處測定吸光值,以g/100 mL的葡萄糖為單位[28]。總酸:采用酸堿滴定法,準確量取適量待測樣品,用80 ℃煮沸過的水在沸水浴中提取30 min后,定容并過濾,濾液用NaOH溶液滴定,以g/100 mL的乙酸為單位[29]。可溶性固形物:采用阿貝折光儀直接測定,數值表示為20 ℃時的質量分數(%)[30]。大腸菌群:依據GB 4789.3-2010中大腸菌群MPN計數法對芒果醋中大腸菌群進行計數,通過觀察月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯管、煌綠乳糖膽鹽肉湯管產氣情況來檢驗,以每mL檢樣中大腸菌群最可能數(MPN)計[31]。沙門氏菌:依據GB 4789.4-2016對芒果醋中的沙門氏菌進行檢驗,以每mL樣品中檢出或未檢出沙門氏菌為結果[32]。金黃色葡萄球菌:依據GB 4789.10-2016第一法對芒果醋中金黃色葡萄球菌作定性檢驗,以每mL樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌為結果[33]。

1.2.7 芒果醋感官評價方法 將在優化條件下發酵得到的芒果醋按照國家標準配制成含0.4%醋酸濃度與鮮芒果汁配制成芒果醋飲料后,以《NY/T 2987-2016 綠色食品果醋飲料》[34]標準為感官評價依據,采用9段愉悅標度[35]評價芒果醋飲料的感官屬性(色澤、滋味和氣味、組織狀態、雜質)和整體評價;給分標準如下:1-極討厭,2-很討厭,3-中度討厭,4-稍討厭,5-既不討厭也不喜歡,6-稍喜歡,7-中度喜歡,8-很喜歡,9-極喜歡。評價小組成員人數為50名,男女各占一半,成員通過在自然光亮處目測色澤、組織狀態和雜質,嗅其氣味、品嘗滋味后對芒果醋的感官屬性和整體評價進行賦分。

1.3 數據處理

每個試驗點重復三次,結果用平均值±標準偏差來表示。實驗數據采用PASW Statistics 18軟件進行方差分析,多重比較采用LSD法。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 芒果汁初始糖度對果醋發酵的影響 由圖1可知,乙酸含量隨發酵糖度的增加而呈現先增加后下降的趨勢,不同芒果汁初始糖度對醋酸發酵的影響顯著(P<0.05)。當初始糖度小于14° Bx時,果醋中乙酸含量隨著芒果汁糖度的增加而升高;初始糖度超過14° Bx后,生成乙酸的含量反而下降。前者糖濃度低,導致酵母菌與醋酸菌得不到充足的營養進行生長繁殖與代謝,因此產乙酸量較低;后者初始糖度過高,對酵母菌的生物活性起到抑制作用,葡萄糖轉化率下降,進而被醋酸菌轉化成的乙酸量就少[36]。再者,由多重比較得出,14° Bx的初始糖度產酸能力較強,其乙酸含量與其它糖度的相比差異顯著(P<0.05)。因此,芒果汁初始糖度為14° Bx最佳。

圖1 芒果汁初始糖度對乙酸含量的影響Fig.1 Effect of the initial sugar content ofmango juice on the content of acetic acid注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖5同。

2.1.2 酵母菌接種量對果醋發酵的影響 由圖2可知,不同酵母菌接種量對產酸含量差異顯著(P<0.05)。酵母菌接種量在小于0.15%范圍內,芒果醋中乙酸含量隨著酵母菌接種量的增加而逐漸升高;當酵母菌接種量為0.15%(v/v)時,產乙酸含量最高,達到4.68 g/100 mL;當酵母菌接種量超過0.15%(v/v)時,乙酸含量明顯下降,這是由于酵母菌快速繁殖消耗了過多的營養,從而導致菌體老化[37],同時,醋酸菌得不到足夠的營養,導致生長受到抑制,產醋酸量減少。由LSD法多重比較可知,0.15%(v/v)接種量的乙酸含量顯著高于其它接種量(P<0.05),因此,選擇酵母菌最佳接種量為0.15%(v/v)。

圖2 酵母菌接種量對乙酸含量的影響Fig.2 Effect of the inoculation quantity ofyeast on the content of acetic acid

2.1.3 醋酸菌添加量對乙酸含量的影響 醋酸菌接種量對菌體的產酸能力和發酵周期具有較大的影響。當接種量過大時,菌體快速增長以及分泌大量的代謝物,從而導致菌體提前老化而衰亡,產酸量減少[38]。醋酸菌的接種量過小,菌體生長慢,發酵周期延長[39],產酸量低。不同的醋酸菌接種量(4%～14%(v/v))對芒果醋發酵的影響見圖3。由圖3可知,不同醋酸菌接種量對醋酸發酵的影響明顯。當接種量為10%(v/v)時,乙酸含量最高,當接種量超過10%時,產乙酸含量迅速下降。由LSD法多重比較可知,10%醋酸菌接種量產酸顯著高于其它接種量(P<0.05),因此,選擇醋酸菌接種量為10%。

圖3 醋酸菌接種量對乙酸含量的影響Fig.3 Effect of the inoculation quantity ofacetic acid bacteria on the content of acetic acid

2.1.4 發酵溫度對果醋發酵的影響 由圖4可以看出,不同發酵溫度對醋酸發酵的影響顯著(P<0.05)。醋酸含量隨著發酵溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢,當發酵溫度為32 ℃,芒果醋中乙酸含量最高,為4.66 g/100 mL;發酵溫度高于32 ℃,加快菌體老化,菌體內酶系活性降低,反而會導致果醋中乙酸含量下降。此外,高溫(36 ℃)對菌體酶系活性破壞比低溫(26 ℃)抑制菌體活性還要大,因此36 ℃下產酸量比26 ℃的產酸量減少了8.72%。由LSD法多重比較可知,32 ℃下產酸顯著高于其它溫度(P<0.05),因此,選擇芒果醋醋酸發酵的發酵溫度為32 ℃。

圖4 發酵溫度對乙酸含量的影響Fig.4 Effect of the fermentation temperature on the content of acetic acid

2.1.5 發酵時間對果醋發酵的影響 由圖5可以看出,在發酵過程中,產酸量隨著發酵周期的延長呈先增加后緩慢下降趨勢,不同發酵時間對乙酸含量的影響明顯。在9 d時,發酵液中的乙酸含量最高,繼續延長芒果醋的發酵時間,產酸量反而下降。可能的原因是當乙醇被醋酸菌完全消耗后,醋酸菌又將部分乙酸降解為H2O和CO2,發生過氧化現象[40]。由LSD法多重比較可知,發酵到第9 d時的產酸量雖然和第10 d的產酸量差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他發酵時間(P<0.05),考慮時間成本、低耗能等因素,選擇發酵9 d為最合適的發酵時間。

圖5 發酵時間對乙酸含量的影響Fig.5 Effect of the fermentation time on the content of acetic acid

2.2 芒果醋發酵正交試驗結果分析

按照表1選取的因素和水平,進行正交試驗,結果見表2。由表2中極差分析可知,各因素對芒果汁發酵液中乙酸含量的影響主次順序為:B(醋酸菌接種量)>D(發酵時間)>C(發酵溫度)>A(芒果汁糖度);其中芒果醋發酵的最優方案為A2B3C2D2,即:芒果汁發酵初始糖度為14 °Bx,醋酸菌加入量為12%(v/v),芒果醋發酵溫度為32 ℃,發酵周期為9 d。對正交實驗結果做主效應的方差分析,結果見表3。由表3可知,根據混菌發酵芒果醋的四個因素的均方大小來判斷主次因素為B>D>C>A,與極差分析結果一致;四個因素對醋酸發酵的影響極顯著(P<0.01)。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 驗證實驗

經極差分析和正交分析,得出最佳組合為A2B3C2D2,但不在正交試驗表中,因此需要進行驗證實驗。將A2B3C1D2和A2B3C2D2兩個方案分別進行3次重復試驗,結果:A2B3C2D2工藝產乙酸含量(4.93±0.02) g/100 mL,比A2B3C1D2工藝的產酸量高1.65%,對兩個組合的結果進行方差分析,結果顯示A2B3C2D2工藝產乙酸含量顯著高于A2B3C1D2工藝的產酸量(P<0.01)。因此,選擇發酵條件的最佳組合為A2B3C2D2,即芒果汁糖度為14 °Bx、醋酸菌接種量為12%(v/v),在32 ℃恒溫振蕩器中發酵9 d,產酸量達到4.93 g/100 mL。

2.4 芒果醋及其飲料的質量指標

2.4.1 感官指標 芒果醋感官評價主要從芒果醋色澤、風味(滋味和氣味)、組織狀態和雜質等方面評分,從圖6可以看出,就色澤而言,成品芒果醋飲料色澤金黃、澄清透明、有光澤,視覺感官讓人十分愉悅,分值為7.8分。從風味來看,芒果醋飲料香氣明顯,有伴有芒果清香,醋飲料味酸,滋味豐富,有層次感,爽口,分值為7.9分。對于飲料的組織狀態來說,醋飲料清澈,較均勻細膩,無分層,無凝塊,分值為6.8分。在正常視力下,芒果醋飲料中無可見外來雜質,分值最高,為9分。綜合色澤、滋味和氣味、組織狀態和雜質等感官屬性的整體評價為8.0分。

圖6 芒果醋飲料的感官評價Fig.6 Sensory evaluation of mango vinegar drink

2.4.2 微生物和理化指標測定 關于所得芒果醋的衛生指標和理化指標見表4和表5。由這兩個表可以看出,所得芒果醋的衛生指標和理化指標都達到了《NY/T 2987-2016 綠色食品果醋飲料》的標準。

表4 芒果醋的微生物指標Table 4 Microbe of mango vinegar

表5 芒果醋的理化指標Table 5 Physicochemical indexes of mango vinegar

3 結論

采用酵母菌醋酸菌混菌發酵芒果汁生產芒果醋的優化條件如下:酵母菌添加量為0.15%(v/v),芒果汁初始糖度為14 °Bx,醋酸菌接種量為12%(v/v),在32 ℃、130 r/min的恒溫搖瓶柜培養9 d,芒果醋中乙酸含量達到4.93 g/100 mL。發酵完成后對芒果醋進行離心澄清,經過陳釀后可得到色澤均勻、金黃,無懸浮物,酸味柔和不刺激,具有芒果獨特的香味和醋香,衛生和理化指標均符合發酵果醋的國家標準要求。將果醋按國家標準配制成芒果醋飲料后,采用9段愉悅評分法進行的感官評定結果表明,芒果醋飲料具有很好的消費者可接受性。所發展出來的新的芒果醋加工方法,能生產出新型的營養保健型果醋及其飲料,具有廣闊的開發價值。