高效液相色譜法測定飲用水中草甘膦的不確定度評定

余秀娟 樊繼鵬 王偉偉 魏曉培 顧娟紅

(1.蘇州海關綜合技術中心，江蘇 蘇州 215104；2. 蘇州華博日化品檢測服務有限公司，江蘇 蘇州 215104)

草甘膦，化學名為N-(膦酰基甲基)甘氨酸，化學分子式為C3H8NO5P，又稱為鎮草寧、農達、草干膦、膦甘酸，屬于弱有機酸，是一種常用的水溶性除草劑，純品為非揮發性白色固體，不溶于一般有機溶劑，不可燃，不爆炸，常溫下可以穩定貯存。草甘膦為內吸傳導性強的廣譜滅生性除草劑，在農業上大量使用的草甘膦除草劑，只有極少部分發揮了作用，多數殘留在土壤或漂浮在大氣中，通過降雨和徑流的沖刷進入地表水或地下水，造成水體污染。隨著草甘膦使用頻率不斷上升，其殘留問題日益受到關注。長期飲用含有草甘膦農藥的水，會危及人體健康，并會造成肝腎、消化道黏膜、皮膚黏膜、神經系統、呼吸系統和心血管系統的損傷，嚴重者可危及生命。因此，草甘膦的檢測技術一直是草甘膦污染防治關注的焦點。目前草甘膦的測定方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、分光光度法、酶聯免疫法、毛細管電泳法、離子色譜法等，其中最常用的方法是高效液相色譜法[1-3]。為了快速、準確測定生活飲用水中痕量草甘膦，保證生活飲用水衛生安全、保護人體健康，本文建立超高效液相色譜-柱后衍生法測定飲用水中草甘膦的檢測方法，對所建立方法測定草甘膦的不確定度進行了評定。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和設備

LC 1260 液相色譜儀，配有自動進樣器(美國 Agilent 公司)；色譜柱：Potassium Cation Exchange柱(150 mm×4.0 mm，8 μm，PICKING公司) ；Milli-型超純水機(Merck Millipore中國有限公司)；PVDF 針式濾器：25 mm×0.22 μm(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.2 試劑

草甘膦標準溶液：100 μg/mL(北京壇墨質檢科技有限公司)；甲醇：HPLC級，純度不低于99.9(德國Merck公司)；K200(0.4%H3PO4、0.1%KH2PO4、99.5%H2O)、RG019(0.3%KOH、99.7%H2O)、GA116(0.1%NaOH、0.1% KH2PO4、1% NaCl、98.8%H2O)、GA104(5.4%KBO3、94.6%H2O)、鄰苯二醛、2-巰基乙醇、草甘膦恢復液(4.1% H3PO4、0.3% KH2PO4、95.6%H2O)；10.0%次氯酸鈉(PICKING公司)；5%次氯酸鈉(國藥集團)；實驗用水為純水。

1.3 分析方法

1.3.1 柱后衍生儀器條件

柱后衍生反應器溫度：36℃；泵流速：0.30 mL/min；衍生劑1：吸取100 μL溶于1000 mL稀釋劑GA116中。衍生劑2：稱取100 mg 鄰苯二醛溶于10 mL甲醇中，稱取2.0g 2-巰基乙醇溶于5 mL稀釋劑GA104中，然后將二者全部溶于1000 mL稀釋劑GA104中，通氮氣脫氣10 min。

1.3.2 液相色譜儀器條件

柱溫：55℃；流量：0.40 mL/min；進樣體積：20 μL；流動相：通道A=K200，100.0%，通道B=RG019，0.00%；梯度洗脫程序：初始 A:B(體積比)=100:0；15.1 min 時，A:B(體積比)=0:100；17.1 min 時，A:B(體積比)=100:0；檢測器：FLD；檢測波長：激發波長Ex=330 nm，發射波長Em=465 nm。

1.4 不確定度來源分析及數學模型的建立

依據JJF 1059.1-2012[4]，本方法的不確定度來源主要有：B類不確定度：(1)標準溶液引入的不確定度urel(1)；(2)標準曲線回歸引入的不確定度urel(2)。A類不確定度：(3)重復性測定產生的不確定度urel(3)。對這些來源產生的不確定度進行量化，本方法的不確定度數學模型為：

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

準確吸取1.0 mL 草甘膦標準溶液于10.0 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，配制成濃度為10.0 μg/mL的標準使用液。稀釋標準使用液配制成濃度為 0.025、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 μg/mL的標準曲線，按照1.3中的儀器條件進行測定，外標法定量。線性范圍為0～2.0 μg/mL，線性回歸方程為Y=27.10205*X-0.150174，相關系數0.9999，保留時間8.602 min(圖1)。

圖1 標準樣品譜圖

2.2 準確度和精密度試驗

用陰性自來水樣品分別添加標準溶液配制成0.10、0.40、2.00 μg/mL三個濃度水平的樣品，每個水平進行6次重復試驗，結果見表1。平均回收率在98.0%～105.0%之間，相對標準偏差在0.7%～5.5%，以3倍信噪比(S/N=3)確定方法的檢出限，本方法檢出限為0.025 μg/mL。該方法檢出限滿足生活飲用水中草甘膦的日常檢測要求。

表1 回收率和精密度試驗結果

2.3 樣品分析

用棕色磨口玻璃瓶采集水樣，采樣時水樣充滿玻璃瓶。當余氯存在時，加入硫代硫酸鈉，使其在水中的濃度達到100 μg/mL。水樣采集后，將樣品溶液于4℃避光保存，并在兩周內測定。分析時，水源水需30000轉/min的轉速下離心5min， 取上清液用PVDF針式濾器將樣品溶液過濾，同標準曲線一起上機測試；出廠水、管網水等清潔水直接用PVDF針式濾器將樣品溶液過濾，同標準曲線一起上機測試。筆者用所建立的方法分別測定了自來水和水源水樣品各10個，均未檢測到草甘膦。

2.4 不確定度評定

2.4.1 標準溶液及配制引入的不確定度urel(1)

草甘膦標準溶液濃度為100 μg/mL，測定的標準不確定度為3.0 μg/mL，則相對標準不確定度分量為：u(1)=3.0/100=0.03。配制標準曲線時，標準使用液為10.0 μg/mL，稀釋10倍使用，則urel(1)=0.03/10=0.003。

2.4.2 標準曲線回歸引入的不確定度urel(2)

草甘膦的標準曲線測定結果見表2。實測值與理論值一一對應關系見表3。

表2 草甘膦的標準曲線測定結果

表3 實測值與理論值對應關系

配制濃度為0.1 μg/mL的標準樣品平行測定6次，響應值分別為2.4024、2.7624、2.8335、2.7177、2.6327、2.7919，代入標準曲線得到的濃度分別0.094 μg /mL、0.107 μg /mL、0.110 μg /mL、0.105 μg /mL、0.103 μg/mL、0.108 μg/mL，其標準不確定度為：

草甘膦標準曲線擬合產生的相對標準不確定度為：urel(2)= u(2)/0.105=0.3905。

2.4.3 重復性測定產生的不確定度urel(3)

實驗室人員操作的重復性、儀器進樣的重復性、數據軟件處理的重復性等因素組成了重復實驗不確定度的來源[5-8]。本實驗室重復測定6次，加標樣品測定結果分別為0.094 μg/mL、0.107 μg/mL、0.110 μg/mL、0.105 μg/mL、0.103 μg/mL、0.108 μg/mL，其平均值為0.105 μg/mL，其標準偏差為0.006 μg/mL。

2.4.4 合成標準不確定度

將所有不確定度分量進行合成，則相對合成標準不確定度

合成不確定度u=0.105×0.3912=0.0412 μg/L

取擴展因子k=2，擴展不確定為：U=0.0412×2=0.0824 μg/L，則草甘膦的測定結果應表示為：(0.105±0.0824)μg/L，k=2。

3 結論

本文采用高效液相色譜法測定飲用水中草甘膦，方法操作簡便，選擇性好，靈敏度高，定量準確，分析時間短。對該方法進行不確定度評定，結果表明B類不確定度中標準曲線回歸引入的不確定度影響最大，A類不確定度重復性測定產生的不確定度影響次之，因此應充分重視標準工作溶液的配制，規范各項操作。分析前，將儀器各項參數調試至最佳狀態，減小由儀器問題帶來的結果偏離。