急性呼吸窘迫綜合征患兒血清miR-21水平與炎性因子水平及臨床預(yù)后的關(guān)系

周莉蓉，王琪，麥碧薇，朱乃云，雷智賢

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見的一種危急重癥，其臨床表現(xiàn)主要為難治性低氧血癥和進(jìn)行性呼吸困難，進(jìn)而出現(xiàn)呼吸衰竭，因而病死率較高，對患兒的生命構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[1-2]。引起ARDS的病因錯(cuò)綜復(fù)雜，至今還未完全闡明，研究認(rèn)為ARDS的病理生理學(xué)機(jī)制與炎性因子失衡密切相關(guān)，炎性因子是ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié)[3]。另有研究報(bào)道，血清炎性因子水平與兒童ARDS的發(fā)生發(fā)展及疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4]。近年來大量研究顯示，microRNA(miRNA)參與了炎性反應(yīng)的調(diào)控過程，其機(jī)制主要是通過與靶基因mRNA 的3’端非編碼區(qū)域結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或抑制轉(zhuǎn)錄翻譯過程，調(diào)控基因的表達(dá)[5]。有報(bào)道稱miR-21在急性肺損傷的小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，與炎性因子的表達(dá)密切相關(guān)，并且在呼吸窘迫綜合征早產(chǎn)兒血清中的表達(dá)水平也明顯升高[6-7]。然而miR-21在兒童ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的作用還不清楚，是否參與調(diào)控了兒童ARDS的炎性水平也未見相關(guān)報(bào)道。因此，現(xiàn)分析ARDS患兒血清miR-21水平與疾病嚴(yán)重程度和炎性因子水平的關(guān)系，并探討miR-21在ARDS患兒中的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月—2019年2月海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心兒童重癥醫(yī)學(xué)科收治的ARDS患兒98例(ARDS組)作為研究對象，男48例，女50例；年齡1個(gè)月～10.5歲，平均年齡(3.6±2.4)歲。按照ARDS柏林定義[8]將ARDS患兒病情嚴(yán)重程度分為3個(gè)亞組，輕度亞組32例，男15例，女17例，年齡1個(gè)月～9.3歲，平均年齡(3.8±2.1)歲；原發(fā)病：肺部感染29例，支氣管異物1例，其他2例。中度亞組36例，男19例，女17例，年齡4個(gè)月～10.5歲，平均年齡(3.4±2.8)歲；原發(fā)病：肺部感染33例，支氣管異物2例，其他1例。重度亞組30例，男14例，女16例，年齡2個(gè)月～10.3歲，平均年齡(3.6±2.3)歲；原發(fā)病：肺部感染27例，支氣管異物1例，其他2例。3亞組患兒的性別、年齡和原發(fā)病比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。同期于本院健康體檢的兒童90例為對照組，男44例，女46例，年齡2個(gè)月～10.3歲，平均年齡(3.8±2.6)歲；近1個(gè)月內(nèi)無感染性疾病，未使用免疫抑制劑。ARDS組和對照組兒童性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際兒童ARDS診斷共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)[9]；②患兒處于急性期(發(fā)病時(shí)間<3 d)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①由心力衰竭導(dǎo)致的呼吸衰竭；②其他原因?qū)е碌暮粑ソ摺?/p>

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-21水平檢測： 收集ARDS患兒入院和健康體檢兒童體檢時(shí)的外周血各3 ml，使用Life Technologies公司的血清RNA提取試劑盒提取總RNA，測量RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為模型進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR, 反應(yīng)體系(10 μl)：cDNA 0.2 μl，F(xiàn)orward primer (10 μmol/L) 0.5 μl，Reverse primer (10 μmol/L) 0.5 μl，ROX Ⅱ (50x) 0.2 μl，SYBR (2x)5 μl，RNase free water 3.6 μl，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物序列

1.3.2 血清炎性因子水平檢測：分別收集ARDS患兒入院和健康體檢兒童體檢時(shí)的外周血3 ml，離心獲得血清。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-17。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自上海碧云天生物公司，由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-21和炎性因子水平比較 與對照組比較，ARDS組患兒血清miR-21、TNF-α、IL-6和IL-17水平均升高(P<0.01)，見表2。

2.2 不同嚴(yán)重程度亞組間血清miR-21和炎性因子水平比較 血清miR-21、TNF-α、IL-6和IL-17水平隨著病情程度加重而升高，重度亞組>中度亞組>輕度亞組(P均<0.01)，見表3。

2.3 不同預(yù)后患兒血清miR-21和炎性因子水平比較 ARDS患兒28 d內(nèi)病死39例，存活59例。死亡亞組患兒血清miR-21、TNF-α、IL-6和IL-17水平高于存活亞組(P<0.01)，見表4。

2.4 血清miR-21水平與炎性因子的相關(guān)性 血清miR-21表達(dá)水平與血清炎性因子TNF-α、IL-6和IL-17水平均呈正相關(guān)(r=0.501、0.462、0.495，P均=0.000)。

2.5 血清miR-21水平預(yù)測ARDS患兒預(yù)后的價(jià)值 血清miR-21曲線下面積為0.796(95%CI0.729～0.862)，最佳臨界值為1.54，敏感度和特異度分別為78.57%和82.65%，Youden指數(shù)為0.612，見圖1。

3 討 論

ARDS是以頑固性低氧血癥和進(jìn)行性呼吸困難為特征的呼吸衰竭[10-11]。兒童ARDS的病死率較高，但臨床上仍缺乏比較可靠的疾病嚴(yán)重程度評估和預(yù)后判斷的指標(biāo)[12]，因此尋找能夠評估兒童ARDS疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后判斷的指標(biāo)具有重要的臨床意義。炎性反應(yīng)是ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié)，在ARDS早期，肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)的炎性細(xì)胞釋放大量的炎性因子，如TNF-α和IL-6，從而加重了炎性反應(yīng)過程，誘導(dǎo)肺組織損傷[13]。IL-17也是炎性反應(yīng)過程中重要的炎性因子，其過度表達(dá)可以對組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷[14]，研究也顯示，IL-17也參與了肺部的炎性反應(yīng)[15]。本研究證實(shí)血清TNF-α、IL-6和IL-17水平在ARDS患兒中升高，并且隨著ARDS病情的加重而升高，與劉靈芝[16]和Mikacenic等[17]的研究結(jié)果一致，說明TNF-α、IL-6和IL-17可以通過激活炎性反應(yīng)造成肺損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致ARDS患兒病情的加重。

圖1 miR-21預(yù)測ARDS患兒預(yù)后的ROC曲線

表2 2組受試者血清miR-21和炎性因子水平比較

表3 不同嚴(yán)重程度亞組血清miR-21和炎性因子水平比較

表4 不同預(yù)后患兒血清miR-21和炎性因子水平比較

研究顯示，miR-21在急性肺損傷的小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，并與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，ARDS患兒血清中miR-21的表達(dá)水平明顯高于健康兒童，并且隨著ARDS患兒病情的加重而升高，說明miR-21參與了ARDS的發(fā)生發(fā)展過程，并與ARDS疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。miRNA可以通過與靶基因mRNA 的3’端非編碼區(qū)域結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或抑制轉(zhuǎn)錄翻譯過程，調(diào)控炎性反應(yīng)基因的表達(dá)，因此，本研究探討了血清miR-21表達(dá)水平與炎性因子水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)血清miR-21表達(dá)水平與TNF-α、IL-6和IL-17呈正相關(guān)，說明miR-21可以調(diào)控TNF-α、IL-6和IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯過程，促使TNF-α、IL-6和IL-17表達(dá)增加，這些炎性因子可以通過血液循環(huán)或水腫液進(jìn)入肺組織，從而激活肺組織的免疫反應(yīng)，一方面可以募集大量炎性細(xì)胞，如嗜中性粒細(xì)胞，進(jìn)入肺組織對抗病原體，另一方面這些炎性細(xì)胞在對抗病原體過程中過度表達(dá)的炎性介質(zhì)進(jìn)一步對肺組織產(chǎn)生損傷，形成炎性反應(yīng)級聯(lián)瀑布放大效應(yīng)，從而加重病情。提示血清miR-21表達(dá)水平可以作為判斷ARDS患兒病情嚴(yán)重程度的輔助指標(biāo)。其機(jī)制可能與二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(dimethylarginine dimethylaminohydrolases 1, DDAH1)/ 非對稱二甲基精氨酸 (asymmetric dimethylarginine,ADMA) /一氧化氮(nitric oxide,NO)信號通路有關(guān)，miR-21表達(dá)下調(diào)，可以通過DDAH1/ADMA/NO信號通路抑制TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá)[18]。此外，ARDS可以引起肺纖維化，從而加重病情[19]，ARDS患兒血清miR-21表達(dá)水平升高，可能通過下調(diào)1 型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 ( a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs，ADAMTS-1)的表達(dá)[20]，促進(jìn)肺纖維化，加重病情。本研究還記錄了ARDS患兒28 d病死情況，死亡亞組患兒入院時(shí)血清miR-21的表達(dá)水平、TNF-α、IL-6和IL-17水平明顯高于存活亞組，提示血清miR-21表達(dá)水平和炎性因子水平高的ARDS患兒預(yù)后較差，分析其原因可能是血清miR-21表達(dá)升高，調(diào)控炎性因子過表達(dá)，激活炎性反應(yīng)，形成炎性反應(yīng)級聯(lián)放大效應(yīng)，進(jìn)一步損傷肺組織，引起肺泡膜的通透性增加，大量的水腫液積聚在肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)，引起肺通氣和換氣功能嚴(yán)重障礙，以致患者肺組織不能進(jìn)行有效的氣體交換，導(dǎo)致患者缺氧并伴有二氧化碳潴留，出現(xiàn)呼吸困難等癥狀，進(jìn)而呼吸衰竭。本研究繪制血清miR-21水平判斷ARDS患兒預(yù)后的ROC曲線，血清miR-21曲線下面積為0.796，說明miR-21對ARDS患兒預(yù)后判斷具有一定的價(jià)值，其最佳臨界值為1.54，敏感度和特異度分別為78.57%和82.65%，說明血清miR-21表達(dá)水平可以用來輔助評估ARDS患兒的預(yù)后情況。

綜上所述，血清miR-21表達(dá)水平在ARDS患兒中明顯升高，并與疾病嚴(yán)重程度和炎性因子水平密切相關(guān)，通過檢測血清miR-21的表達(dá)有助于評估患兒的病情嚴(yán)重狀況和預(yù)后情況。由于受到樣本量的限制，還需要進(jìn)一步采用大型的隊(duì)列研究驗(yàn)證血清miR-21表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度和炎性因子的關(guān)系，此外，還需要從分子生物學(xué)角度深入探究miR-21是通過何種信號通路增強(qiáng)了ARDS患兒的炎性反應(yīng)，以明確miR-21在ARDS患兒致病過程中的作用，為臨床治療提供有價(jià)值的信息。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周莉蓉：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫,論文修改；王琪：實(shí)施研究過程，資料搜集整理;麥碧薇：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;朱乃云：課題設(shè)計(jì)；雷智賢：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核