硫酸氨基葡萄糖聯合依托考昔對膝骨性關節炎軟骨修復作用機制研究

朱琳，孫玄靜，陳鵬，顧向浩，周云

膝骨性關節炎(KOA)是一種常見的中老年女性群體多發的慢性進行性骨關節退變性疾病[1]。不同程度的關節僵硬、疼痛，局部腫脹、畸形和功能障礙是該病的主要臨床表現，進行性關節軟骨破壞和退變，軟骨下骨硬化或囊性變，關節滑膜增生，關節邊緣形成骨贅，關節囊攣縮或肥大，以及韌帶攣縮或松弛等是其病理特征[2]。關于膝骨性關節炎的病理機制尚不十分清楚，目前仍缺乏特異性的治療方法，減輕疼痛，控制疾病進展，結合患者病情決定使用藥物或非藥物治療是當前的治療原則。作為一種天然的氨基酸單糖，硫酸氨基葡萄糖能補充軟骨基質，使軟骨降解減緩，促進軟骨細胞合成蛋白聚糖，是軟骨的營養類藥物[3]。依托考昔是環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的特異性抑制劑，作為非甾體類抗炎藥，具有止痛、抗炎及退熱的作用[4]。臨床上常將2種藥物聯合使用治療膝骨性關節炎且已取得顯著療效，然而未見硫酸氨基葡萄糖聯合依托考昔對關節軟骨修復的作用機制報道，因此本研究旨在探討兩者聯合用藥對膝骨性關節炎軟骨修復的作用機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2019年5月徐州市中醫院風濕免疫科診治膝骨性關節炎患者106例作為研究對象。隨機分為2組，對照組40例，男9例，女31例，平均年齡(62.07 ±11.32)歲；平均病程(3.59±0.75)月；發病部位，左膝18例，右膝22例；Kellgren-Lawrence分級，Ⅰ級9例，Ⅱ級15例，Ⅲ級16例。觀察組66例，男14例，女52例，平均年齡(61.58±10.24)歲；平均病程(3.74±0.89)月；發病部位，左膝35例，右膝31例；Kellgren-Lawrence分級，Ⅰ級16例，Ⅱ級27例，Ⅲ級23例。2組患者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。 本研究已通過醫院醫學倫理委員會審核批準，患者及家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 選擇標準 (1)診斷標準：均符合美國風濕病學會制定的標準[5]，①年齡>40 歲；②1個月內大多數時間有膝關節疼痛癥狀；③晨僵持續時間<30 min；④活動時關節有摩擦音；⑤關節滑液檢查有骨關節炎癥狀；⑥X 線片觀察可見關節邊緣形成骨贅。(2)納入標準：均符合以上診斷標準且單膝發??；對硫酸氨基葡萄糖和依托考昔無過敏史。(3)排除標準：患者合并內分泌系統、消化系統、血液系統、心、肝、腎及腫瘤等疾病；合并肢體先天畸形、皮膚病、膝關節局部急性創傷等疾?。换加蓄愶L濕性關節炎、化膿性關節炎、創傷性關節炎、痛風、強直性脊椎炎等風濕性疾??；近1個月內使用過皮質激素類和非甾體抗炎類藥物、免疫調節劑，以及其他湯藥、中成藥或接受過理療；患有精神類、意識功能障礙等疾??；患者病歷資料丟失或不全，中途退出者。

1.3 治療方法 對照組給予依托考昔[Merck Sharp&Dohme(Australia)Pty.Ltd生產]60 mg/次口服，1次/d。觀察組在對照組基礎上予硫酸氨基葡糖鉀膠囊(留普安，山西康寶生物制品股份有限公司生產) 0.5 g/次口服，3次/d，2組均連續治療6周。治療期間囑患者注意保暖，指導其進行股四頭肌舒縮功能鍛煉，禁止跑步、下蹲、爬樓梯及爬山等加重膝關節負重的活動，若出現任何可能與治療方案有關的不良反應均立即停藥并退出本研究項目。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 臨床療效評價：臨床控制，膝關節腫脹、疼痛等臨床癥狀和體征完全消失，關節功能恢復正常；顯效，靜息時無膝痛，偶爾活動時疼痛，關節功能明顯恢復，對工作和生活均不產生影響；有效，膝痛有時發作，行走時輕度疼痛，膝關節功能基本恢復，上下樓梯稍感不便；無效，治療后腫脹、疼痛等臨床癥狀未改變，膝關節功能無好轉。總有效率=(臨床控制+顯效+有效)/總例數×100%。

1.4.2 膝關節功能評估：治療前后采用西安大略和麥克馬斯特大學(WOMAC)骨關節炎指數量表評估，該量表由3部分，共24項組成，每項評分有5個等級，無困難為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分，極度為4分，滿分96分；其中疼痛情況有5項，滿分20分；關節僵硬程度有2項，滿分8分；關節功能有17項，滿分68分。得分越高說明患者膝骨性關節炎病情越重。

1.4.3 骨代謝指標檢測：分別于治療前和治療后行關節腔穿刺抽取關節液5～10 ml，其中1～2 ml采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，嚴格參照試劑盒說明書檢測骨鈣素(BGP)、骨保護素(OPG)、Ⅱ型膠C-端肽(CTX-Ⅱ)、軟骨寡聚基質蛋白(COMP)、核轉錄因子κB受體活化因子配體(RANKL)。人CEACAM1 ELISA試劑盒(BGP)、人Osteoprotegerin ELISA試劑盒、人COMP ELISA試劑盒、人TNFSF11 ELISA試劑盒(RANKL)均為Abcam產品，Cytochrome P450 27A1 (CYP27A1) BioAssay ELISA Kit (Human)為USBiological產品。

1.4.4 生長因子檢測：上述關節液1～2 ml，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，嚴格參照試劑盒說明書檢測轉化生長因子β (TGF-β)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、成纖維細胞生長因子2 (FGF-2)。人TGF-β ELISA試劑盒、人IGF-1 ELISA試劑盒、人FGF-2 ELISA試劑盒均為Abcam產品。

1.4.5 炎性因子檢測：上述關節液1～2 ml，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，嚴格參照試劑盒說明書檢測白介素1β (IL-1β)、IL-17、IL-18、腫瘤壞死因子α (TNF-α)。人IL-1 β ELISA試劑盒、人IL-17 ELISA試劑盒、人IL-18 ELISA試劑盒、人TNF-α ELISA試劑盒均為Abcam產品。

1.4.6 基質金屬蛋白酶檢測：上述關節液1～2 ml，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，嚴格參照試劑盒說明書檢測基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、MMP-9、MMP-13。Human Total MMP3 ELISA Kit、Human MMP9 ELISA Kit、Human MMP-13 ELISA Kit均為proteintech 公司產品。

1.4.7 NO誘導凋亡的相關因子檢測：上述關節液1～2 ml，采用相應試劑盒，嚴格參照試劑盒說明書檢測一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化脂質(LPO)。NO測定試劑盒(酶法)比色法、SOD測定試劑盒(WST-1 法)、LPO試劑盒均為南京建成公司產品。

1.4.8 JNK和Wnt5a的mRNA檢測：采用Trizol法提取治療前后關節液中總RNA并進行反轉錄，以得到的cDNA作為模板，進行RT-qPCR，以檢測C-Jun氨基末端激酶(JNK)和Wnt5a的表達情況，JNK上游引物序列:5’-CGGGATCTTCAACTTTAACAT GGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAA-3’，下游引物:5’-CCCAAGCTTACTCCTACTAAAAAGCACTTACTTTTAAAGTC-3’；Wnt5a上游引物:5'-CACACACTACATCAGTGGCTCAAAG-3'，下游引物:5'-TCCAGCACATGAACGTGTAAACAG-3'；同時將GAPDH(上游引物:5’-CTTTAACATGGAAGTGCGGGA-3’，下游引物:5’-CTAAAAAGCACTTACCCCAAGCTATC-3’)作為內參基因，每個樣本均重復進行3次試驗。

2 結 果

2.1 2組臨床療效比較 治療6周后，觀察組總有效率達92.43%，高于對照組的67.5%(χ2=20.770，P=0.000)，見表1。

表1 2組患者臨床療效比較 [例(%)]

2.2 2組治療前后WOMAC量表評分比較 2組患者治療前各項評分和WOMAC總分比較差異均無統計學意義(P>0.05)； 2組患者治療6周后各指標均降低(P<0.01)，且觀察組均低于對照組 (P<0.01)，見表2。

表2 2組患者治療前后WOMAC量表評分比較

2.3 2組治療前后骨代謝指標比較 治療前2組患者關節液中BGP、OPG、CTX-Ⅱ、COMP及RANKL水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；治療6周后2組BGP和OPG升高，CTX-Ⅱ、COMP及RANKL均降低，且觀察組升高/降低幅度大于對照組(P<0.01)，見表3。

表3 2組患者治療前后骨代謝指標比較

2.4 2組治療前后生長因子水平比較 治療前2組TGF-β、IGF-1及FGF-2水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；治療6周后2組各指標均升高，且觀察組高于對照組(P<0.01)，見表4。

表4 2組患者治療前后生長因子水平比較

2.5 2組治療前后炎性因子和基質金屬蛋白酶水平比較 治療前，2組炎性因子及基質金屬蛋白酶水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；治療6周后2組各指標均降低(P<0.01)，且觀察組均低于對照組 (P<0.01)，見表5、6。

表5 2組患者治療前后炎性因子水平比較

表6 2組患者治療前后基質金屬蛋白酶水平比較

2.6 2組治療前后JNK 和Wnt5a的mRNA 水平比較 治療前2組患者JNK 和Wnt5a的mRNA 水平比較差異均無統計學意義 (P>0.05)。治療6周后2組均降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)，見圖1。

注：與治療前比較，aP<0.05；與對照組相同時間點比較，bP<0.05

2.7 2組治療前后NO誘導凋亡因子比較 治療前2組患者關節液中NO、SOD及LPO水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療6周后2組NO和LPO均降低，SOD水平升高，且觀察組降低/升高優于對照組 (P<0.01)，見表7。

表7 2組患者治療前后NO誘導凋亡因子比較

3 討 論

現代醫學理論認為[6]，關節軟骨變形、丟失，軟骨下骨和關節邊緣骨質再生是KOA的重要特征，且關節軟骨是該病的始發部位，因此治療過程中，在保證疼痛減輕、疾病進展得到控制的同時，更應該促進軟骨組織的修復。本研究結果表明，硫酸氨基葡萄糖聯合依托考昔和單獨使用依托考昔均有顯著療效，且兩者聯合用藥療效優于單獨使用依托考昔，該結果與以往諸多文獻報道結果一致[7]。此外本研究發現，硫酸氨基葡萄糖鉀聯合依托考昔治療KOA能夠更好地調節患者骨代謝指標以延緩或阻止關節退變，促進生長因子分泌以修復軟骨組織，進而改善關節功能。存在于人體關節軟骨中的氨基葡萄糖是氨基聚糖合成過程中所需的基本物質，口服硫酸氨基葡萄糖鉀可使軟骨基質直接得到補充，軟骨降解減緩，利于軟骨蛋白合成及軟骨細胞基質分泌功能恢復，進而使關節軟骨結構改善[8]。依托考昔能選擇性抑制環氧合酶、前列腺素的合成，發揮抗炎作用，從而使關節腫脹疼痛等癥狀有效緩解[9]。

大量研究表明，炎性反應為KOA的主要病理特征，炎性因子是破壞關節軟骨及引發腫脹、疼痛的重要因素，且炎性因子主要通過一系列的級聯放大反應發揮作用[10-13]。IL-1β可促進基質金屬蛋白酶的分泌，進而導致軟骨細胞基質降解，軟骨細胞凋亡[14]。IL-17通過對軟骨細胞的分解代謝發揮強力誘導作用，從而促進軟骨降解，此外還能刺激IL-6生成，間接促進基質金屬蛋白酶的分泌[14]。IL-18則具有誘導一氧化氮、前列腺素E2等產生的作用，進而參與KOA炎性反應發生、關節損傷的過程[15-16]。TNF-α可以使白細胞被激活并聚集，抑制Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，抑制軟骨的自身修復并促進軟骨降解。作為一組金屬依賴性蛋白酶類，基質金屬蛋白酶具有降解關節軟骨細胞外基質的作用[17-18]。由滑膜細胞和軟骨細胞分泌的MMP-3不僅能使多種細胞外基質中的基質蛋白底物發生降解，還能使MMP-9和MMP-13等酶原被激活從而產生級聯放大反應，MMP-9通過破壞軟骨基質和膠原形成的網狀結構而使膠原降解，MMP-3和MMP-9協同作用可加速破壞進程，并使膠原軟骨的變化不可逆轉。目前最有效的Ⅱ型膠原降解酶MMP-13，可降解各種膠原，直接破壞關節軟骨的完整性。本研究結果提示，硫酸氨基葡萄糖和依托考昔可抑制炎性因子的分泌，進而降低基質金屬蛋白酶水平，從而減緩軟骨基質降解，利于受損軟骨細胞修復。以往研究表明[19]，在關節炎軟骨破壞過程中，IL-1β可上調Wnt5a的表達，而Wnt5a可通過JNK信號途徑介導而上調基質金屬蛋白酶的表達。本研究結果表明，硫酸氨基葡萄糖聯合依托考昔治療KOA，在降低IL-1β水平并抑制基質金屬蛋白酶過程中，有JNK 和Wnt5a的參與。

作為導致軟骨細胞凋亡的一條重要途徑，NO誘導的凋亡與NO、LPO和SOD關系密切[20]。在KOA發病過程中機體產生的大量自由基具有促進凋亡作用[21]。自由基的重要成員NO通過誘導軟骨細胞凋亡而加重軟骨細胞損傷。自由基脂質過氧化反應的代謝產物LPO，可對細胞及細胞膜的結構造成損傷，該指標常用于間接反映自由基對組織細胞的損傷程度。SOD可通過歧化作用將體內氧自由基清除，還能阻斷細胞色素C依賴的線粒體凋亡途徑，從而對滑膜和軟骨細胞發揮保護作用。本研究結果提示，硫酸氨基葡萄糖聯合依托考昔對KOA軟骨的修復作用，可能是通過增加SOD水平，抑制脂質過氧化反應，而使自由基減少，軟骨細胞凋亡被抑制，最終對軟骨起到保護和修復的作用。

綜上，硫酸氨基葡萄糖聯合依托考昔對KOA軟骨的修復作用，可能是通過降低炎性因子水平使JNK 和Wnt5a表達下調以抑制基質金屬蛋白酶的分泌，進而減緩軟骨基質的降解；或通過SOD途徑抑制NO誘導的軟骨細胞凋亡。今后將采取構建動物模型或在細胞水平進行研究，進一步驗證本結論。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

朱琳:設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；孫玄靜:提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；陳鵬：課題設計；顧向浩、周云: 實施研究過程，資料搜集整理，論文修改