慢性髓系白血病患者SHP-1基因、id4基因甲基化狀態(tài)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系

鄭偉，侯志新，劉承祥，張雷，韓松

慢性髓系白血病(CML)多起源于多能干細(xì)胞，其起病緩慢，且臨床癥狀無特異性，因此早期診斷較為困難[1]。相關(guān)資料顯示，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要方式之一，且其與造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。研究指出，抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可造成基因沉默，是CML發(fā)生、發(fā)展的重要分子機(jī)制[3]。而含SH-2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶1(SHP-1)為胞質(zhì)酪氨酸磷酸酶，其可對(duì)下游信號(hào)蛋白分子產(chǎn)生脫磷酸化作用，從而有效調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的功能[4]。另DNA結(jié)合抑制因子4(id4)為抑癌基因的一種，其主要存在于各類生物細(xì)胞中，可被甲基化，從而抑制基因表達(dá)。而目前關(guān)于二者甲基化狀態(tài)與CML疾病進(jìn)展的關(guān)系研究報(bào)道較少。基于此，本研究探討CML患者SHP-1基因、id4基因甲基化狀態(tài)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系，以期為臨床防治提供參考。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2015年5月—2019年5月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六四醫(yī)院血液科收治CML患者78例為研究對(duì)象(病例組)，男43例，女35例；年齡9～71(42.68±3.80)歲。根據(jù)病情程度分為慢性期24例，加速期30例，急變期24例；選取同期于醫(yī)院健康體檢者42例作為健康對(duì)照組，男23例，女19例；年齡8～70(42.06±3.28)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意并簽署同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①CML患者符合“中國(guó)慢性髓性白血病診斷與治療指南”(2016版)[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②CML分期明確者；③臨床資料完整，能夠配合完成本次研究者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎等功能障礙者；②合并其他惡性腫瘤者；③妊娠及哺乳期婦女；④有智力或精神障礙不能配合者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 白細(xì)胞提取：取患者骨髓5 ml，肝素抗凝，并加入淋巴細(xì)胞分離液5 ml，使用低溫高速離心機(jī)(Hreaeus，德國(guó)，Sigma3-18K)進(jìn)行離心，棄上清,細(xì)胞計(jì)數(shù)。再繼續(xù)加入PBS緩沖液5 ml，離心后在CO2培養(yǎng)箱(Hreaeus，德國(guó)，WCI-180)37℃中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最后將細(xì)胞進(jìn)行液氮凍存待測(cè)。

1.3.2 mRNA基因表達(dá)：采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞總RNA的提取使用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.3.3 MS-PCR法檢測(cè)SHP-1、id4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)：(1)白細(xì)胞復(fù)蘇。離心管預(yù)熱(培養(yǎng)液10 ml)，凍存管置于38℃恒溫水浴箱(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，HWT-6B)水浴，凍存細(xì)胞吸入離心管，離心，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液混勻(10 ml)，再次離心棄上清。(2)DNA提取。收集細(xì)胞，離心，棄上清，加PBS緩沖液(180 μl)，混勻，加Proteinase K 20 μl(混勻、室溫孵育2 min)，加10% SDS 10 μl，加無水乙醇200 μl，全部溶液置入吸附柱，離心，棄流出液，加CB溶液500 μl，離心，棄流出液，加WBI溶液500 μl，離心，棄流出液，DNA洗脫，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?3)DNA濃度測(cè)定。DNA提取后，進(jìn)行電泳同時(shí)使用紫外線分光光度計(jì)(德國(guó)SPECTRO)測(cè)OD值。(4)DNA修飾。按照Methylamp DNA Modification Kit 說明嚴(yán)格操作。(5)PCR擴(kuò)增。使用PCR擴(kuò)增儀(上海之江生物科技股份有限公司)，PCR體系為25 μl ，其中DNA 2 μl ，上游、下游引物各為2.5 μl ，綠色PCR體系12.5 μl ，ddH2O 5.5 μl 。引物序列見表1。PCR條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性45 min，54 ℃ 退火45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。(6)產(chǎn)物檢測(cè)。制膠、凝固、上樣、電泳(120 V，35 min)(電泳儀，北京六一生物科技有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)分析儀(上海復(fù)星實(shí)業(yè)股份有限公司)下攝片。

表1 MS-PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

注：SHP-1甲基化(M)、SHP-1非甲基化(U)、id4甲基化(M)、id4非甲基化(U)引物

2 結(jié) 果

2.1 2組SHP-1、id4基因表達(dá)水平比較 2組患者SHP-1、id4基因表達(dá)水平比較，健康對(duì)照組>慢性期>加速期>急變期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但加速期、急變期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 2組受試者SHP-1、id4基因表達(dá)水平比較

注：與健康對(duì)照組比較,aP<0.05；與CML慢性期比較，bP<0.05

2.2 2組SHP-1、id4基因啟動(dòng)子甲基化率比較 健康對(duì)照組SHP-1、id4基因甲基化陽(yáng)性率均為0；病例組慢性期分別有6例(25.00%)、0例，加速期分別為29例(96.67%)、20例(66.67%)，急變期分別為24例(100.00%)、17例(70.83%)。加速期及急變期CML患者SHP-1、id4基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于健康對(duì)照組及慢性期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 2組受試者SHP-1、id4基因基因啟動(dòng)子甲基化率比較 [例(%)]

2.3 MSP法測(cè)定SHP-1、id4蛋白凝膠成像圖 CML患者骨髓SHP-1、id4基因甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為158/158 bp、155/156 bp。甲基化擴(kuò)增結(jié)果顯示，SHP-1基因、id4基因在健康者中呈非甲基化陽(yáng)性，在CML患者中呈甲基化狀態(tài)。見圖1。

SHP-1基因

id4基因

注： M、U分別代表甲基化陽(yáng)性、非甲基化陽(yáng)性；圖1、2中1～5分別代表CML患者骨髓標(biāo)本甲基化與非甲基化結(jié)果，6～7為正常者骨髓標(biāo)本甲基化與非甲基化結(jié)果

圖1 SHP-1基因和id4基因甲基化凝膠成像圖

3 討 論

CML多發(fā)于50歲以上人群，骨髓髓系增生、外周血白細(xì)胞增多及脾臟腫大是其主要特征[6]。相關(guān)研究指出，CML可分為慢性期、加速期及急變期，其起病緩慢，且在慢性期癥狀表現(xiàn)無特異性，因此易被忽視。而進(jìn)展期常表現(xiàn)為臟器浸潤(rùn)，并出現(xiàn)惡化，急變期預(yù)后較差，可危及患者生命，因此早期發(fā)現(xiàn)CML尤為重要。目前關(guān)于CML疾病進(jìn)展的分子機(jī)制尚不明確，但有研究認(rèn)為，CML不同時(shí)期基因甲基化差異顯著。邵明等[7]研究表明，細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程中，甲基化現(xiàn)象的出現(xiàn)要明顯早于惡性表型，因此相關(guān)基因的甲基化檢測(cè)對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及防治具有重要意義。

甲基化為蛋白質(zhì)和核酸一種重要的修飾，其可對(duì)基因的表達(dá)和關(guān)閉進(jìn)行調(diào)節(jié)，并與腫瘤疾病關(guān)系密切[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，基因整體甲基化的降低及CpG局部甲基化的異常升高是造成癌癥的一個(gè)重要原因。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)CpG甲基化異常升高時(shí)，可造成基因沉默發(fā)生，在癌癥中即表現(xiàn)為抑癌基因表達(dá)降低或不表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[9-10]。表觀遺傳學(xué)指出，對(duì)于基因失活現(xiàn)象的治療主要以抑制DNA甲基化及組蛋白脫乙酰基兩方面進(jìn)行[11]。而SHP-1基因、id4基因均為抑癌基因，二者在CML疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不明確，是否參與CML的發(fā)生及發(fā)展需要進(jìn)一步的研究。

SHP-1基因主要存在于造血細(xì)胞中，其可對(duì)下游信號(hào)蛋白分子磷酸酪氨酸進(jìn)行脫磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)受體酪氨酸激酶、抗原受體復(fù)合物等信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)一步對(duì)造血干細(xì)胞的增殖與凋亡進(jìn)行調(diào)控[12-13]。現(xiàn)國(guó)內(nèi)外較多文獻(xiàn)指出，SHP-1基因結(jié)構(gòu)異常在CML中較為少見，其失活機(jī)制多表現(xiàn)為啟動(dòng)子的甲基化。且劉曉等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)，SHP-1基因在正常者中均不呈現(xiàn)甲基化，而在CML患者中，其甲基化陽(yáng)性率隨CML病情程度的加重而升高。本研究中，健康對(duì)照組SHP-1基因mRNA表達(dá)水平顯著高于病例組各期，CML慢性期患者顯著高于CML急變期、加速期患者，且健康對(duì)照組甲基化陽(yáng)性率為0，CML慢性期、加速期及急變期的甲基化陽(yáng)性率分別為25.00%、96.67%、100.00%。該結(jié)果與上述研究結(jié)論相符，具有一致性，提示CML中，SHP-1基因失活或沉默現(xiàn)象可能為其啟動(dòng)子的甲基化。而id4基因?yàn)槁菪h(huán)—螺旋轉(zhuǎn)錄因子亞家族的一員，其多存在于各類生物細(xì)胞中。資料顯示，id分子本身缺少DNA結(jié)合所需要的堿性氨基酸序列，因而與bHLH結(jié)合后，可形成異二聚體結(jié)構(gòu)，從而對(duì)bHLH與DNA的結(jié)合產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而阻抑細(xì)胞分化[15]。因此id4基因可作為抑癌基因，而當(dāng)其被甲基化后，會(huì)導(dǎo)致基因發(fā)生沉默，基因表達(dá)產(chǎn)生抑制，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本研究顯示，CML加速期及急變期id4基因mRNA表達(dá)水平均低于慢性期，且健康對(duì)照組及慢性期CML組中，甲基化陽(yáng)性率均為0，而CML加速期及急變期的甲基化陽(yáng)性率分別為66.67%、70.83%，與慢性期及健康對(duì)照組差異顯著。提示id4基因mRNA表達(dá)受限與CML疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且其甲基化可作為預(yù)測(cè)CML疾病進(jìn)展的標(biāo)志因子，對(duì)CML的診斷及治療具有積極意義。

綜上所述，SHP-1基因、id4基因在健康者中呈非甲基化，在CML慢性期甲基化較低，在加速期或急變期則呈高甲基化狀態(tài)，因而其甲基化可作為預(yù)測(cè)CML疾病進(jìn)展的標(biāo)志因子，對(duì)CML的診斷及治療具有積極意義。本研究不足為樣本量偏小，仍有待進(jìn)一步行大樣本研究證實(shí)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

鄭偉：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；侯志新：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);劉承祥：實(shí)施研究過程，資料搜集整理;張雷：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;韓松：課題設(shè)計(jì)，論文修改，論文審核