CYP-EET信號通路對大鼠MCAO缺血再灌注后血管新生影響的研究

劉陽，鄭小龍，喻志源，王偉，謝敏杰

血管新生在腦缺血后神經修復中具有重要作用。腦缺血時血流中斷引起氧和營養物質供給障礙，細胞能量代謝紊亂，離子穩態失衡，細胞凋亡。腦缺血后新生血管的形成增加了缺血區血流供應，促進了新生血管網絡的形成，為缺血缺氧組織提供能量，促進神經損傷的修復[1]。細胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)表氧化酶可代謝花生四烯酸而生成一種小分子活性物質—環氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)。根據環氧基位置的不同，EETs分為4種亞型: 5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET。研究報道，EETs主要由CYP表氧化酶家族中CYP2C和CYP2J 2種亞型代謝花生四烯酸而生成。EETs在體內被表氧化物水解酶(soluble epoxidehydrolase, sEH)代謝生成沒有活性或活性很低的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET)從而構成一個完整的系統發揮生理作用。既往研究報道，EET具有非常廣泛的生物學功能，包括擴張血管，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，細胞遷移及抗炎等[2]。然而，腦缺血后CYP-EET信號系統對梗死邊緣區血管新生的影響及其相關機制目前尚不清楚。本研究采用外源性14,15-EET或sEH選擇性抑制劑12-(3-金剛烷-1-基-脲基)十二烷酸[12-(3-adamantan-1-yl-ureido)dodecanoic acid，AUDA]增加內源性EETs的含量，研究CYP-EETs信號系統對大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)缺血再灌注后血管新生及相關信號通路的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：SPF 級健康成年SD 雄性大鼠80 只，體質量220～250 g，由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗動物中心提供。所有動物實驗均嚴格遵循實驗動物倫理委員會的相關規定，并獲得華中科技大學實驗動物倫理委員會同意；(2)試藥試劑：p-Erk兔多克隆抗體、p-Akt兔多克隆抗體(購自美國Cell Signaling 公司)，GAPDH鼠單克隆抗體(購自武漢谷歌生物科技有限公司),vWF兔多克隆抗體(購自美國Abcam公司),VEGF鼠單克隆抗體(購自美國Abcam公司),VEGFR兔多克隆抗體(購自美國Cell Signaling公司), cy3 標記山羊抗兔IgG(購自美國Jackson ImmunoResearch公司)，IRDye 800-conjugated山羊抗兔IgG，Alexa Fluor700-conjugated 山羊抗小鼠IgG(購自美國LI-COR Biosciences公司)，RIPA強蛋白裂解液(購自美國Pierce公司)，BCA蛋白定量試劑盒(購自美國Thermo公司)，蛋白酶抑制劑cocktail，磷酸化蛋白酶抑制劑(購自美國Roche公司)，蛋白Marker(1811)(購自美國Fermentas公司)，凝膠配置試劑盒(購自武漢谷歌生物科技有限公司)，NC膜(購自美國Millipore公司)，14,15-DHET ELISA試劑盒(購自美國Detroit R&D公司)；(3)儀器設備：Alzet給藥微泵2001型、Alzet Brain Infusion Kits 2(購自美國 Durect公司)，SR-6N 立體定位儀(購自日本Narishige 公司)，CM1900 冰凍切片機(購自德國Leica 公司)，Odyssey IR成像系統(購自美國LI-COR Biosciences公司)，激光共聚焦顯微鏡(購自日本Olympus公司)。

1.2 動物分組及造模 2017年6月—2018年4月于華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院進行實驗。

1.2.1 動物分組：研究分為2部分。(1)研究大鼠MCAO后不同時間點腦內14,15-EET的變化，大鼠分為假手術組和缺血(MCAO)組，分別于缺血再灌注后1 d、3 d、7 d檢測各組大鼠腦組織14,15-EET；(2)研究CYP-EET信號系統對大鼠MCAO缺血再灌注后血管新生、VEGF/VEGFR、Erk、Akt信號通路的影響，大鼠分為假手術組、溶劑對照組、14,15-EET干預組、AUDA干預組，分別于缺血再灌注后1 d、3 d、7 d進行檢測，其中1 d、3 d檢測VEGF、p-Erk、p-Akt蛋白水平；7 d檢測vWF、VEGFR陽性的微血管密度。

1.2.2 動物造模：以參考文獻[3]的方法建立大鼠MCAO模型。采用右側頸內動脈插入線栓的方法阻斷同側大腦中動脈血流，首先腹腔注射氯胺酮和異丙嗪復合麻醉大鼠，采用仰臥位并固定，暴露右側頸總動脈；結扎頸外動脈及頸總動脈近心端，用動脈夾夾閉頸內動脈；在頸總動脈遠心端用顯微剪做一切口，將線栓由此切口緩慢插入頸內動脈，直至線栓頭部到達右側大腦中動脈處；激光多普勒血流監測可見血流下降值約為基線水平的 70%～80%即造模成功[4]；缺血1 h后緩慢拔出線栓實施缺血后再灌注。假手術組不插入線栓，其余操作與上述一致。手術期間，利用保溫墊使直腸溫維持在(37.0±0.5)℃。干預組缺血前30 min采用Alzet給藥微泵持續側腦室給藥，藥物濃度為14,15-EET 10 μmol/L，AUDA 1 mmol/L，溶劑對照組注射含有相同濃度二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水，給藥劑量參照文獻[5]，給藥時間為7 d,Alzet給藥微泵的使用嚴格按照說明書操作。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 14,15-EET檢測：采用14,15-DHET ELISA競爭性試劑盒檢測大鼠MCAO缺血再灌注后1、3、7 d腦組織勻漿中14,15-DHET含量,最終換算為腦組織14,15-EET的水平。測定嚴格按照儀器和試劑盒要求進行。

1.3.2 vWF及VEGFR陽性的微血管密度檢測：采用免疫熒光技術檢測。大鼠深度麻醉后斷頭取腦，-80℃異戊烷速凍，-20 ℃冰凍切片機切片，厚度為10 μm，貼于多聚賴氨酸包被的玻片上。4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定15 min，0.01 mol/L PBS 漂洗后0.25%Triton-X100 破膜，10%BSA 室溫封閉2 h，加入一抗vWF(1∶400)、 VEGFR(1∶100)4℃孵育過夜。陰性對照采用抗體稀釋液孵育過夜，0.01 mol/L PBS漂洗后避光加入二抗cy3 標記山羊抗兔抗體(1∶400)，室溫孵育1 h。Olympus激光共聚焦顯微鏡采集圖像。每張切片隨機選取5個視野，同一曝光參數下采集圖像，Image-J軟件統計分析每個視野下vWF及VEGFR陽性的微血管密度。

1.3.3 腦組織蛋白濃度檢測： 采用Western-bolt法測量。大鼠深度麻醉后斷頭取腦，取缺血邊緣區大腦皮質，RIPA 裂解液提取總蛋白，離心取上清，蛋白變性后制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠并加樣電泳，將蛋白轉膜至0.45 μm 醋酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，p-Erk兔多克隆抗體(1∶500)、p-Akt兔多克隆抗體(1∶500),VEGF 鼠單克隆抗體(1∶500)，GAPDH 鼠單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，0.5% TBST 漂洗(6 min×4 次)，IRDye 800-conjugated 羊抗兔二抗(1∶5 000), Alexa Fluor700-conjugated山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)室溫避光孵育1 h；用Odyssey IR紅外顯像系統檢測蛋白條帶的免疫活性，記錄平均吸光度(mean optical density)，并以GAPDH為內參進行校正。

2 結 果

2.1 大鼠MCAO后不同時間點腦內14,15-EET的變化 大鼠MCAO缺血再灌注后1、3、7 d腦組織勻漿中總的14,15-EET比較，第1 d缺血組低于假手術組(P<0.05)；第3、7 d缺血組均高于假手術組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠MCAO后不同時間點腦內14,15-EET水平比較

2.2 各組腦組織vWF及VEGFR陽性的微血管密度比較 采用血管內皮細胞特異性標志物vWF標記微血管內皮細胞, 第7天，溶劑對照組明顯低于假手術組(P<0.05)，14，15-EET干預組、AUDA干預組明顯高于溶劑對照組(P<0.05)。

采用VEGFR標記新生血管，第7天，溶劑對照組明顯高于假手術組(P<0.05)，14，15-EET干預組明顯高于溶劑對照組(P<0.05)；AUDA干預組雖然較溶劑對照組增多，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表2。

表2 干預后vWF和VEGFR陽性微血管密度比較

2.3 各組腦組織VEGF蛋白表達比較 采用Western-bolt方法檢測VEGF蛋白表達，第1天及第3天時，溶劑對照組明顯高于假手術組(P<0.05)，14，15-EET干預組、AUDA干預組明顯高于溶劑對照組(P<0.05)，見圖2、表3。

表3 各組干預后VEGF蛋白表達水平比較

注：與假手術組比較，aP< 0.05；與溶劑對照組比較，bP< 0.05

2.4 各組腦組織干預后p-Akt和p-Erk蛋白表達比較 Western-bolt結果顯示，第3天時，溶劑對照組p-Akt及p-Erk蛋白水平均明顯高于假手術組(P<0.05)，14，15-EET干預組、AUDA干預組明顯低于溶劑對照組(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 各組干預后p-Akt和p-Erk蛋白表達水平比較

注：A.紅色熒光代表血管內皮細胞標志物vWF，標尺=100 μm;B.紅色熒光代表VEGFR陽性新生血管，標尺=50 μm

圖1 各組vWF及VEGFR陽性的微血管密度比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與溶劑對照組比較,bP<0.05

圖3 各組干預后p-Akt、p-Erk蛋白表達比較

3 討 論

CYP表氧化酶-EETs信號系統在中樞神經系統的正常生理和多種神經系統疾病中都具有重要的作用。生理情況下，EETs被認為是突觸傳遞的重要調節因子，參與腦血流的調節、皮質血管新生、抗細胞凋亡、調節神經激素的生成等[6]。Li等[7]研究發現，在小鼠全腦缺血模型中，腦組織及血漿中14,15-DHET水平較對照組顯著升高，過表達CYP2J2小鼠腦缺血后梗死體積、細胞凋亡較野生型小鼠顯著減少，說明EETs在腦缺血過程中發揮神經保護作用。本研究也發現，MCAO后3、7 d時腦內14,15-EET含量顯著升高，但是1 d時14,15-EET含量卻減少，推測該變化可能的原因是腦缺血急性期大量細胞壞死，導致EETs生成減少，而后期膠質細胞增殖活化，血管內皮細胞新生后EETs的生成代償增多。

研究發現，EETs發揮神經保護作用的機制主要與抗凋亡、抗炎性反應、抗血栓形成等有關。Geng等[8]研究發現，EETs通過抑制Caspase-3的激活、細胞色素C釋放發揮抗凋亡作用，減少梗死體積。Liu等[9]發現EETs通過減少缺血后炎性因子TNF-α、IL-6、NF-κB、iNOS分泌，發揮神經保護作用。此外，也有研究發現EETs在腫瘤、心肌梗死、視網膜等疾病中具有促進血管新生的作用[10-11]，然而EETs信號系統在腦缺血中是否具有促進血管新生的作用尚不清楚。故本研究建立MCAO缺血再灌注模型，分別通過側腦室注射外源性14,15-EET和AUDA增加內源性EETs，觀察其對血管新生的影響。結果發現，外源性加入14，15-EET或sEH抑制劑AUDA可顯著增加缺血邊緣區微血管密度。VEGF參與腦缺血后一系列神經損傷修復的過程，包括促進神經元存活、血管新生、神經前體細胞的增殖、遷移和分化[12-13]。 VEGFR-2作為VEGF的重要受體表達于內皮細胞和神經元，VEGF/VEGFR信號通路在血管新生及神經損傷與修復中扮演了重要角色[14]。Sommer等[15]研究發現，EETs可顯著增加VEGF表達，促進缺血誘導的創傷處血管新生；Zhao等[16]報道，EETs增加心肌梗死后VEGF的表達，促進血管新生。此外，Zhang等[17]研究發現，sEH抑制劑可促進缺氧缺糖時星形膠質細胞分泌VEGF，激活神經元VEGFR，減少神經元凋亡，發揮神經保護作用。研究表明，有絲分裂原活化蛋白激酶(Erk)及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)磷酸化等機制可能是VEGF/VEGFR的下游通路[18-20]。與此類似，本研究發現外源性加入14，15-EET或sEH抑制劑AUDA可顯著上調缺血邊緣區VEGF和VEGFR的表達，同時抑制Erk和Akt的蛋白磷酸化水平，說明EET的血管新生作用與上調VEGF/VEGFR的表達密切相關，Erk及Akt信號通路可能是其重要機制之一。

綜上所述，本研究在MCAO缺血再灌注模型中發現，CYP-EET信號系統可以增加缺血邊緣區微血管密度，可能與VEGF/VEGFR信號通路激活有關。后期尚需要更多體外細胞水平的信號通路研究加以證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉陽：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；鄭小龍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核; 喻志源、王偉、謝敏杰：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改