腹部推拿聯合5-HT4受體激動劑調節SCF/c-kit信號通路對STC大鼠的作用研究

馬鑫文，王程，張瑞春，屈玉疆，劉俊昌

慢傳輸型便秘(slow transit constipation, STC)是由于大腸功能紊亂、傳導失常而導致的排便周期延長和排便困難。其發病機制可能與腸神經系統、中樞神經及自主神經系統調節功能障礙、激素水平異常等多種因素有關[1-6]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT) 是參與調節胃腸道分泌和運動功能的重要神經遞質和旁分泌信號分子。其中 5-HT3受體(5-HT3R)、5-HT4受體(5-HT4R)與胃腸道動力存在緊密聯系。莫沙必利是目前臨床上常使用的 5-HT4受體激動劑之一，常被用來調節胃腸道動力，促進腸道蠕動。腹部推拿是中醫特色療法之一，近年研究表明，腹部推拿能夠明顯改善慢傳輸型便秘的臨床癥狀，緩解患者的疾病狀態[3-6]，但其作用機制目前尚未明確。現通過研究腹部推拿聯合5-HT4受體激動劑對STC大鼠進行治療并觀察療效，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性SD大鼠65只， SPF級，6周齡，體質量(180±20)g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，自由進食、飲水飼養于實驗動物房。(2)試藥試劑：SCF、c-kit和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RNA提取試劑盒購自Promega公司，RIPA蛋白裂解液、P物質(SP)、一氧化氮(NO)、5-HT及血管活性腸肽(VIP)檢測ELISA 試劑盒購自上海碧云天公司，ECL顯色液購自Thermo公司。(3)儀器設備：酶標儀(MB-530)購自濟南好來寶醫療器材有限公司，雙垂直電泳儀(DYCZ-25D)、轉印電泳儀(DYCZ-40G)購自北京六一儀器有限公司，凝膠成像儀(Gel Doc XR)購自伯樂生命醫學產品有限公司，離心機(FC5718 230V)購自奧豪斯國際貿易(上海)有限公司。

1.2 STC大鼠模型的建立 2017年10月—2018年6月于新疆維吾爾自治區中醫藥研究院進行實驗。65只大鼠隨機數字表法分為5組：對照組、模型組、推拿組、莫沙必利組、推拿聯合莫沙必利組(聯合組)，每組13只。除對照組外，其余各組大鼠采用腸神經節消融術造模，大鼠麻醉后仰臥于手術臺上，無菌條件下取腹部正中切口，長約4 cm，充分暴露結腸，取寬度約1 cm雙層紗布，使用生理鹽水完全浸濕，包繞全部結腸，紗布長度與腸管相當，保持紗布濕潤，每5 min沿紗布長軸間隔約1 cm各滴3滴0.25%苯扎氯銨溶液，其余器官用濕紗布覆蓋、隔離，共30 min，術后逐層關腹；對照組不做處理，相同條件下繼續喂養。所有大鼠術后12 h恢復正常飼養，自由進食、飲水，給予青霉素鈉1周，注意觀察大鼠排便、精神和營養狀況。為確保實驗結果可靠性和減少誤差，所有模型制備均由指定動物實驗員完成，且以糞粒干燥、粒形縮短、排便費力、日排便量低于對照組大鼠作為造模成功的標準。造模成功后，對各組大鼠進行稱重，記為初始體質量，推拿組按照特定方法進行腹部推拿。莫沙必利組大鼠予0.15 mg/ml莫沙必利10 ml/kg灌胃，聯合組每天予推拿+0.15 mg/ml莫沙必利10 ml/kg灌胃，每日1次，連續給藥14 d。對照組及模型組只擺相同體位，不進行腹部推拿。除莫沙必利組及聯合組，其余各組根據大鼠體質量予生理鹽水10 ml/kg灌胃，每日1次，連續給予14 d。

1.3 腹部推拿方法 根據參考文獻[16]方法，選用腹部推拿中核心手法“按法”“摩法”作為主要干預手法。為保證手法的一致性，實驗前應用YF-3 手法測定儀采集操作手法信息，對手法的用力大小、頻率等進行標定，建立手法操作模型。實驗過程中由專人操作，手法操作者除掌握手法要點外，還需應用 YF-3手法測定儀進行評測，待其手法的力度大小、頻率形成的波形軌跡與手法模型基本一致后，方可用于實驗大鼠。取穴參考《實驗推拿學》[17]，選取大鼠的關元穴、中脘穴。腹部按法: 手法操作者以右手食指、中指二指疊按置于關元穴上，余指并攏。以右手腕關節為支點，食、中二指掌指部主動施力，向恥骨聯合脊柱方向徐徐按下，力量自輕至重，待指面感覺到大鼠腹部動脈輕微搏動，按而留之，完成此過程大約30 s，后維持此時的壓力及其所達到的深度，靜待 1 min 后掌指部徐徐上提，直至完全離開受壓部位，此過程大約持續 30 s。如此反復操作 2 次，共 4 min。腹部摩法: 手法操作者肘關節自然屈曲，腕部放松，指掌自然伸直，食指、中指并攏。以食指、中指指面著于施術部位，以腕關節為中心，連同掌、指作環形摩動，并以中脘穴為圓心，做順時針方向節律性環旋運動，頻率宜緩，每分鐘20～30次，操作6 min，每天治療 1 次，連續治療 14 d。

1.4 觀測指標與方法

1.4.1 體質量、糞便含水率測定：實驗期間大鼠正常飲食，每日收集各組大鼠糞便，稱重后記為濕重，然后置于90℃恒溫干燥箱內干燥3 h至恒重，記為干重，并按照以下公式計算各組大鼠糞便含水率，糞便含水率=(濕重-干重)/濕重×100%；在最后一次推拿及給藥24 h后，再次對各組大鼠進行稱重，記為最終體質量，計算各組大鼠體質量增加值(體質量增加值=最終體質量-初始體質量)。

1.4.2 血漿SP、NO、5-HT及VIP水平測定： 采取大鼠眼眶后靜脈叢血2 ml至肝素潤洗過的離心管中，室溫靜置5 min，然后離心取上清液，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測SP、NO、5-HT及VIP水平。

1.4.3 大鼠腸推動率測定：每組取6只大鼠，禁食不禁水24 h 后，每只大鼠予濃度為100 g/L的活性炭混懸液1 ml灌胃， 1 h后行烏拉坦腹腔注射麻醉，立即解剖，取出從幽門至直腸末端的全部腸道，測量腸道全長及幽門至黑色物質前端的距離，計算腸推動率(%)=黑色物質自幽門至腸道末前端的距離/腸道全長×100%。

1.4.4 大鼠結腸組織蛋白檢測：每組取6只大鼠，大鼠頸椎脫臼處死后迅速分離結腸組織，用生理鹽水清洗干凈腸道內容物，用濾紙吸干表面水分后，取部分結腸組織用于實時定量PCR檢測，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解， 4℃離心留取上清液，向其中加入SDS緩沖液，混勻后放入100℃水浴5 min，然后放入-20℃儲存備用。將凍存的結腸組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取蛋白50 μg進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經SCF、c-kit及GAPDH抗體(1∶1 000)孵育后，4℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進行灰度值檢測。

1.4.5 大鼠結腸組織RNA檢測：采用RNA提取試劑盒分別提取各組大鼠結腸組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉錄成cDNA后，熒光實時定量PCR檢測各組大鼠結腸組織中β-actin、5-HT3R和5-HT4R mRNA的表達。各檢測基因的實時定量PCR引物見表1，實時定量PCR結果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 實時定量PCR檢測的基因引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠體質量增加值比較 與對照組比較，模型組體質量增加值較高(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組大鼠體質量增加值均依次降低(P<0.05)，且與推拿組及莫沙必利組比較，聯合組STC大鼠體質量增加值降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠體質量增加值比較

2.2 各組大鼠糞便含水率比較 與對照組比較，模型組STC大鼠糞便含水率降低(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組大鼠糞便含水率依次升高(P<0.05)，且聯合組大鼠較推拿組及莫沙必利組均顯著升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠糞便含水率比較

2.3 各組大鼠血漿SP、NO、5-HT及VIP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血漿SP水平降低(P<0.05)，NO、5-HT及VIP水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組大鼠血漿SP水平均升高(P<0.05)，NO、5-HT及VIP水平均降低(P<0.05)；同時，聯合組較推拿組及莫沙必利組升高/降低顯著(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠血漿SP、NO、5-HT及VIP水平比較

2.4 各組大鼠腸推動率比較 與對照組比較，模型組大鼠腸推動率顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組大鼠腸推動率均顯著升高(P<0.05)，同時，聯合組大鼠腸推動率較推拿組及莫沙必利組顯著升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠腸推動率比較

2.5 各組大鼠結腸組織中5-HT3R及5-HT4R mRNA表達比較 與對照組比較，模型組大鼠結腸組織5-HT3R及5-HT4R mRNA水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組大鼠結腸組織5-HT3R及5-HT4R mRNA水平均顯著升高(P<0.05)，同時，聯合組較推拿組及莫沙必利組顯著升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 各組大鼠結腸組織中5-HT3R及5-HT4R mRNA表達比較

2.6 各組大鼠結腸組織SCF、c-kit蛋白水平比較 與對照組比較，模型組大鼠結腸組織SCF、c-kit水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組均升高(P<0.05)，且聯合組較推拿組及莫沙必利組升高(P<0.05)，但推拿組與莫沙必利組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與推拿組比較，cP<0.05；與莫沙必利組比較，dP<0.05

圖1 各組大鼠結腸組織SCF、c-kit蛋白表達水平比較

3 討 論

STC是由于大腸功能紊亂，傳導失常而導致的排便周期延長和排便困難。臨床以大便干結、排便次數減少、排便費力伴腹脹等為主要癥狀。目前，STC 的發病機制尚不能完全明確，其發病機制可能與腸神經系統及cajal間質細胞、中樞神經及自主神經系統調節功能障礙、激素水平異常等有關[1-3]。此外，長期不良的生活習慣，如起居無規律、飲食過于精細、減肥、節食及缺少運動等，均可使腸道受刺激不足，排便動力缺乏，糞便在腸腔內滯留時間過久而形成慢傳輸型便秘[4-8]。

5-HT是參與調節胃腸道分泌和運動功能的重要神經遞質和旁分泌信號分子。研究發現，5-HT 參與腹瀉、便秘型腸易激綜合征及慢傳輸型便秘的病理生理過程，5-HT3受體(5-HT3R) 、5-HT4受體(5-HT4R)與胃腸道動力存在緊密聯系，其分泌、轉運異常都能引起胃腸道疾病，此外，5-HT4受體激動劑可以增強小鼠結腸運動功能，增強腸道的傳輸功能[9-12]。莫沙必利作為臨床常用的5-HT4受體激動劑之一，其能夠促進胃腸道平滑肌收縮和蠕動，同時具有增加近端結腸傳輸的功能[13-16]。現代研究顯示，腸神經遞質失調是導致功能性便秘的主要病理變化之一，5-HT、NO、SP、VIP是調節腸道功能的重要神經遞質，可對腸道運動發揮興奮或抑制作用進行調節。

中醫學認為便秘多由飲食不節、情志失調等因素所致，其病位在大腸，與肺、脾、腎、肝相關。腹部推拿是中醫特色療法之一[15]。穴位主要指人體經絡線上特殊的點區部位，中醫可以通過針灸或者推拿、點按、艾灸刺激相應的經絡點治療疾病。通過推拿按摩腹部穴位，可直接作用于胃腸，加速腸蠕動，減少腸道對糞便水分的吸收，同時也增強腹肌力量，從而有利于便秘的改善[17-20]。

腹部推拿是中醫學治療胸腹部疾病的一種常見治療手段，現代醫學認為，使用促進胃腸道蠕動的藥物能夠治療胃腸道蠕動功能異常疾病，而中醫推拿學認為，通過相應按摩手法能夠達到疏通經絡、推行氣血、扶傷止痛、祛邪扶正、調和陰陽的目的，兩者概念雖不同，其本質相同，腹部推拿也間接借助外力促進了胃腸道的蠕動[21]。本研究首次通過大鼠腸神經節消融術建立STC大鼠模型，對STC大鼠進行連續14 d的腹部推拿聯合5-HT4受體激動劑莫沙必利干預后，觀察其對大鼠體內SCF/c-kit信號通路的影響及STC大鼠體內相關指標的變化和疾病轉歸情況。結果表明，與模型組比較，推拿組、莫沙必利組、聯合組STC大鼠糞便含水率顯著增加，血漿SP水平顯著升高，NO、5-HT及VIP水平均顯著降低，結腸組織中5-HT3R及5-HT4R mRNA水平、SCF、c-kit水平均顯著升高，且聯合組大鼠各項指標轉歸效果均顯著優于推拿組及莫沙必利組，提示腹部推拿聯合5-HT4受體激動劑能協同促進胃腸道蠕動，進而強效改善STC大鼠癥狀，促進疾病轉歸。

綜上所述，腹部推拿聯合5-HT4受體激動劑能夠調節STC大鼠體內SCF/c-kit信號通路，緩解STC大鼠疾病狀態，改善其疾病轉歸。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

馬鑫文：提出研究思路、研究選題；王程：設計研究方案、研究流程；張瑞春：實施研究過程，數據收集；屈玉疆：進行文獻調研與整理，數據分析；劉俊昌：修訂論文、論文終審