宮頸微環(huán)境中ILC3細胞的表達及相關影響因素的分析

許瑩瑩 劉萍 馮勤梅

山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院婦科（太原030001）

宮頸癌發(fā)病越來越年輕化，嚴重影響女性健康［1］。其發(fā)生、發(fā)展是一個比較漫長的過程，一般癌前病變需要數(shù)十年的時間才能發(fā)展為癌癥［2］。目前普遍認為高危型HPV 的持續(xù)性感染是導致宮頸病變的主要原因，然而若機體免疫力正常，即便感染HPV，也會在一定時間內(nèi)被清除。因此機體免疫在宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepitheli?al neoplasia，CIN）的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。但是由于HPV 病毒的感染局限于子宮頸和黏膜，因而宮頸及陰道的局部免疫可能是病毒清除的重要決定因素［3］。

先天性淋巴細胞（innate lymphoid cell，ILC）是新近發(fā)現(xiàn)的一種固有淋巴細胞，根據(jù)ILC 發(fā)育、調(diào)控以及分泌的細胞因子分為4 類，3 類ILC 即ILC3，其發(fā)育依賴于轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關孤兒受體γt（RORγt），能夠在IL-1β和IL?23 的刺激下分泌IL?22、IL?17 等細胞因子發(fā)揮免疫作用，參與炎癥反應、抗病毒感染及粘膜穩(wěn)態(tài)的維持，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用［4］。但是對于ILC3 在陰道微生態(tài)、人乳頭瘤病毒（HPV）感染以及CIN 的發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。因此，本文擬對不同CIN 組織中ILC3 的變化進行研究，以期為CIN 的發(fā)生、發(fā)展及治療找尋機制。

(1) 微網(wǎng)運行控制技術 與傳統(tǒng)的電力系統(tǒng)控制技術不同,微網(wǎng)側(cè)重并、離網(wǎng)控制技術(分布式電源控制技術有下垂控制技術、v/f控制技術、p/v控制技術)。此外,微網(wǎng)整體運行控制也是微網(wǎng)領域的熱點和趨勢。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年11月至2019年4月就診于我院的149 例宮頸病變患者為研究組，其中CINⅠ級30 例、CINⅡ級37 例、CINⅢ級36 例、宮頸癌患者46 例。選擇同期在我院因良性疾病進行子宮全切且病理檢查為宮頸炎的患者36 例為對照組。篩選標準：（1）經(jīng)病理診斷為宮頸炎、CIN 或?qū)m頸癌患者；（2）有性生活史、無子宮切除史、無其他免疫性疾病史；（3）非月經(jīng)期、妊娠期及哺乳期女性；（4）取材前3 天無陰道沖洗、無陰道用藥、無婦科檢查、無性生活。研究組平均（44.97± 10.89）歲；對照組平均（44.81 ± 8.00）歲，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

2.3 宮頸組織中ILC3 細胞的表達CD3-IL17+細胞組間比較：CINⅡ組、CINⅢ組、癌癥組與對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組與癌癥組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CINⅠ組與CINⅡ組、CINⅢ組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.1 宮頸病變與pH 值、細菌性陰道病（BV）的關系宮頸病變組的pH 值高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；BV 的感染率隨著CIN 程度的升高而增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

細菌性陰道病的診斷標準：（1）勻質(zhì)、稀薄、白色的陰道分泌物，常粘附于陰道壁；（2）線索細胞陽性；（3）pH＞4.5；（4）胺臭味試驗陽性。4 項符合3 項即可診斷。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計分析采用t檢驗和方差分析，多因素分析采用Logistic回歸分析，后續(xù)行兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

1.2.3 ILC3 細胞免疫組化按照Spits［5］的定義，分泌IL?17 或者IL?22 的非T 細胞定義為ILC3 細胞，即將CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞定義為ILC3 細胞。因此，按照邁新雙染試劑盒步驟進行操作，IL17、IL22 表達為藍色，CD3 表達為粉色，最終由兩名病理醫(yī)生在高倍顯微鏡下進行觀察，選取5 個陽性細胞較多的高倍視野進行計數(shù)，取平均值。

從表2中的數(shù)據(jù)可看出，用GM(1，1)模型得到的預測值并不是很理想，其平均相對誤差為0.038 2%。利用GM(1，1)預測模型來預測第8次沉降值，得到的預測沉降值為20.76，相對誤差為0.055%，后驗差比值C為0.065。

2.6 宮頸病變的危險因素經(jīng)多分類Logistic 回歸分析，以宮頸癌組作為參照組，與CINⅠ組相比，BV 感染是危險因素；與CINⅡ組相比，BV 感染CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞個數(shù)< 8 是危險因素與CINⅢ組相比，BV感染，CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞個數(shù)< 8 是危險因素，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表7、8。

1.2.2 宮頸脫落細胞窺器暴露陰道，用無菌采樣刷沿宮頸轉(zhuǎn)5 ～8 圈刷取轉(zhuǎn)化區(qū)細胞，放入固定液中，采用聚合酶鏈反應技術（PCR）檢測HPV 感染情況，并進行宮頸脫落細胞的檢測（TCT）。

學生是課堂授課的主體，在開展“對分課堂”教學的前期，要與學生進行充分的溝通.一方面，傳達“對分課堂”的教學理念，目的是在于讓學生充分的參與到物理課堂中，親自動手模擬物理實驗，生成數(shù)據(jù)，通過計算和繪制圖表最終得到物理定理.另一方面，初次課程實踐時應選取已經(jīng)學過的知識開展.突然的模式轉(zhuǎn)變可能會對學生的接受能力受到影響，尤其是涉及《選修2》和《選修3》的內(nèi)容，十分深奧難懂，不適合作為教學探索階段的實驗課.每節(jié)體驗課結束后要對學生的學習成果進行匯總，聽取學生意見，例如對教材的理解，講課思路的意見等，做好收集記錄.

2 結果

1.2.1 陰道微生態(tài)窺器暴露陰道，取2 根無菌長棉簽伸入陰道側(cè)壁上1/3 段近穹隆處，旋轉(zhuǎn)5 周，使棉簽上附著有清晰分泌物。將1 根棉簽涂抹于載玻片，后將棉棒置入加有2 mL 生理鹽水的無菌管中，充分混勻后用進行微生態(tài)分析；載玻片干片后進行革蘭染色，油鏡下觀察細菌、真菌；將一根棉簽置入加有2 mL 生理鹽水的無菌管中，攪拌后滴片，顯微鏡下觀察滴蟲。

表1 CIN 與pH 值、BV 的關系Tab.1 Relationship between cervical lesions and pH value、BV infection

2.4 ILC3與HPV感染之間的關系感染HPV16/18的宮頸組織中比未感染HPV16/18 的宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞數(shù)量少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

任何時代環(huán)境下女性都是相對于男性而言更為敏感的群體，她們是時代社會發(fā)展的導向標。李劼人的《死水微瀾》《暴風雨前》和《大波》中女性鮮明地反映了這一特征，她們處在時代社會發(fā)展最敏感的地帶，她們受傳統(tǒng)壓迫最嚴重，卻對現(xiàn)代社會最敏銳。她們以自身的身心變化反應著時代社會的變化發(fā)展。李劼人人筆下的女性有著傳統(tǒng)婦女所沒有的自由獨立，對婚姻愛情的執(zhí)著追求，而這些正是當代女性身上所體現(xiàn)的品格。她們在時代洪流中具有先導性和先鋒性。

表2 HPV 感染與pH 值、BV 的關系Tab.2 Relationship between HPV infection and pH value and BV infection 例（%）

CD3-IL22+細胞組間比較：研究組各分組均與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組與癌癥組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.5）；CINⅠ組與CINⅡ、CINⅢ組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3、圖1-10。

表3 不同病變級別宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞數(shù)目Tab.3 Numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+cells in different cervical lesiom tissues ±s

表3 不同病變級別宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞數(shù)目Tab.3 Numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+cells in different cervical lesiom tissues ±s

組別CD3-IL17+CD3-IL22+對照組17.06±3.71 18.31±3.36 CINⅠ組14.00±2.97 15.20±1.83 CINⅡ組11.11±4.52 10.38±3.15 CINⅢ組9.50±3.38 8.69±2.82癌癥組4.50±1.82 4.02±1.81 F 值50.47 62.38 P 值＜0.05＜0.05

圖1 宮頸組織炎癥CD3-IL17+（雙染，200×）Fig.1 Cervical tissue，inflammation，CD3-IL17+（DouS?P，200×）

圖2 宮頸組織CINⅠCD3-IL17+（雙染，200×）Fig.2 Cervical tissue，CINⅠ，CD3-IL17+（DouS?P，200×）

圖3 宮頸組織CINⅡCD3-IL17+（雙染，200×）Fig.3 Cervical tissue，CINⅡ，CD3-IL17+（DouS?P，200×）

圖4 宮頸組織CINⅢCD3-IL17+（雙染，200×）Fig.4 Cervical tissue，CINⅢ，CD3-IL17+（DouS?P，200×）

圖5 宮頸組織癌癥CD3-IL17+（雙染，200×）Fig.5 Cervical tissue，cancer，CD3-IL17+（DouS?P，200×）

圖6 宮頸組織炎癥CD3-IL22+（雙染，200×）Fig.6 Cervical tissue，inflammation，CD3-IL22+（DouS?P，200×）

圖7 宮頸組織CINⅠCD3-IL22+（雙染，200×）Fig.7 Cervical tissue，CINⅠ，CD3-IL22+（DouS?P，200×）

圖8 宮頸組織CINⅡCD3-IL22+（雙染，200×）Fig.8 Cervical tissue，CINⅡ，CD3-IL22+（DouS?P，200×）

圖9 宮頸組織CINⅢCD3-IL22+（雙染，200×）Fig.9 Cervical tissue，CINⅢ，CD3-IL22+（DouS?P，200×）

圖10 宮頸組織癌癥CD3-IL22+（雙染，200×）Fig.10 Cervical tissue，cancer，CD3-IL22+（DouS?P，200×）

2.2 HPV 感染與pH 值、BV 的關系HPV 陽性患者中陰道pH 值＞4.5 的概率為86.30%，高于HPV陰性患者陰道pH 值＞4.5 的概率69.23%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HPV 陽性患者BV 發(fā)生率為39.0%，高于HPV 陰性患者的BV 發(fā)生率17.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表4 不同HPV 感染狀態(tài)的宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+數(shù)目Tab.4 Numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues of different HPV infection states ±s

表4 不同HPV 感染狀態(tài)的宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+數(shù)目Tab.4 Numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues of different HPV infection states ±s

CD3-IL17+CD3-IL22+HPV16/18（+）7.34±3.91 7.35±4.24 HPV16/18（-）13.31±4.74 13±4.87 t 值8.69 7.83 P 值＜0.001＜0.001

2.5 ILC3 與PH 值、細菌性陰道病（BV）之間的關系陰道微環(huán)境中pH≤4.5 比pH＞4.5 的宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞數(shù)量多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；BV 感染者與未感染者宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5、6。

表5 陰道不同PH 值對宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+數(shù)目的影響Tab.5 Effect of different PH values on the numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues ±s

表5 陰道不同PH 值對宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+數(shù)目的影響Tab.5 Effect of different PH values on the numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues ±s

PH CD3-IL17+CD3-IL22+pH ≤4.5 14.75±4.46 14.71±4.67 pH＞4.5 9.98±5.09 9.93±5.18 t 值4.34 4.27 P 值＜0.001＜0.001

1.3 觀察指標觀察并分析不同宮頸組織中ILC3細胞（即CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞）的表達情況，進而分析影響ILC3 表達的因素。

表6 陰道BV 感染狀態(tài)對宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+數(shù)目的影響Tab.6 Effect of vaginal BV infection on the numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues ±s

表6 陰道BV 感染狀態(tài)對宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+數(shù)目的影響Tab.6 Effect of vaginal BV infection on the numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues ±s

CD3-IL17+CD3-IL22+BV（+）9.46±5.37 8.63±5.79 BV（-）11.51±5.60 11.90±5.50 t 值-2.39-3.97 P 值<0.05<0.05

表7 宮頸病變影響因素多因素Logistic分析（變量賦值表）Tab.7 Multivariate Logistic analysis of influencing factors of cervical lesions（table of variable assignment）

3 討論

既往研究認為，陰道微生態(tài)在HPV 感染以及接下來的CIN 的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用［6］。陰道內(nèi)環(huán)境平衡的破壞將引起多種生殖道感染性疾病，如BV、滴蟲性陰道炎（TV）、外陰陰道假絲酵母菌病（VVC）、HPV 感染，甚至引起宮頸惡性病變［7］。陰道微生態(tài)失衡可破壞陰道微環(huán)境固有免疫防護機制，增加HPV 異常粘附，從而使上皮細胞受損［8］，增加病毒感染及宮頸細胞異常增生的可能。而且各類厭氧菌代謝產(chǎn)生的亞硝基胺的致癌作用，加速宮頸上皮細胞的轉(zhuǎn)變，進一步增加CIN的風險［9］。本研究中發(fā)現(xiàn)，HPV 感染患者陰道微環(huán)境pH 值異常率、BV 感染率均高于HPV 未感染患者，表明陰道微生態(tài)失衡與HPV 感染之間存在關系；此外，本研究發(fā)現(xiàn)BV 感染率隨著宮頸病變級別的升高而升高，且宮頸病變多因素分析表明，BV 是宮頸癌前病變進展為宮頸癌的危險因素，這與之前的研究一致［9］。這些結果也證明了陰道內(nèi)環(huán)境與HPV 感染、宮頸病變之間的關系。

表8 宮頸病變影響因素多因素Logistic 分析Tab.8 Multivariate Logistic analysis of influencing factors of cervical lesions

本研究發(fā)現(xiàn)當pH 值升高時，宮頸組織中CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞的表達減少（P＜0.05），表明健康的陰道微環(huán)境對于維持宮頸組織局部正常免疫具有重要作用。pH 值作為陰道微生態(tài)平衡狀況的一項重要指示指標，與陰道微生物菌群的生長情況密切相關，當pH 值升高時，陰道內(nèi)乳酸桿菌的生長受到抑制，菌群平衡被打破，進而可導致患者出現(xiàn)HPV 持續(xù)感染；而HPV 感染又進一步加劇陰道菌群失衡，使局部的免疫微環(huán)境形成的生物屏障遭到破壞，進而使宮頸局部的免疫功能出現(xiàn)異常，形成惡性循環(huán)，導致CIN［10-11］。在人類受試者中，缺乏T 輔助細胞17（Thelper cell 17，Th17）和ILC3 細胞的患者對于白色念珠菌易感，小鼠模型中，RORγt 缺陷者也不能控制白色念珠菌的感染。這表明ILC3 可能對白色念珠菌的感染也起著很大的作用［12］。而本研究中并沒有表現(xiàn)出ILC3與VVC 的關系。本研究表明BV 陰性患者宮頸局部CD3-IL17+/CD3-IL22+細胞少，可能說明此時免疫功能低，導致BV 易感。因此考慮陰道微生態(tài)的變化導致陰道局部免疫功能的變化，使HPV 更容易感染，繼而引起CIN 的發(fā)生發(fā)展。

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眾所周知HPV 感染是CIN 的病因，感染HPV后，若機體免疫功能正常，可清除病毒。若機體免疫功能下降，不能清除HPV，則HPV 便整合至宿主細胞，使細胞抑癌基因突變，導致細胞異常增殖和惡變，引起CIN。研究表明高級別宮頸病變患者CD4+T 細胞少于CINⅠ患者，且T 細胞變化與HR?HPV有關［13］，表明高危型HPV 感染會導致局部免疫功能下降。本研究表明，HPV 感染者宮頸組織中ILC3 細胞表達減少。ILC3 主要是通過分泌細胞因子IL?22 直接作用于非造血細胞，調(diào)節(jié)適應性免疫，來介導組織抵抗病原體的感染［14］。當ILC3 減少時，所分泌的細胞因子減少，介導的非造血細胞產(chǎn)生的清除病毒的作用也下降。

ILCs 可以在感染和組織損傷后早期分泌細胞因子IL17、IL22，因此在細胞因子介導的免疫系統(tǒng)激活和促進上皮細胞屏障完整性中具有關鍵作用。這表明ILCs 不但可以在癌變的早期階段發(fā)揮作用，但最終也會塑造腫瘤微環(huán)境。它不但可以通過表達能夠識別癌細胞的自然細胞毒性受體（natural cytotoxicity receptor，NCR）NKp46 和NKp44識別腫瘤細胞，也可以通過與輔助細胞如樹突狀細胞、巨噬細胞或上皮細胞相互作用識別癌細胞，輔助細胞表達炎性小體，炎性小體是一種大型的蛋白質(zhì)復合體，能夠感知各種損傷相關的分子模式，并在損傷組織中啟動免疫反應，促進IL?1β的產(chǎn)生，進而激活ILC3［15］。ILC3 被激活后，分泌細胞因子，引起一系列的抗腫瘤反應。在慢性結腸炎模型中，早期IL?22 的產(chǎn)生被認為通過限制組織損傷在癌變中發(fā)揮保護作用。IL?17 可以通過T 細胞依賴性機制抑制腫瘤細胞生長，內(nèi)源性IL?17 在接種結腸癌細胞株的小鼠中有助于降低腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［15］。在黑色素瘤的實驗模型中，表達NKp46 的細胞通過轉(zhuǎn)錄因子RORγt促進腫瘤排斥反應［16］。本研究結果為CD3-IL17+細胞、CD3-IL22+細胞均隨著宮頸病變程度的增加而表達減少，表明ILC3 在宮頸病變中表達減少。先前研究也認為ILC3 在非小細胞肺癌、黑色素瘤等癌癥中表達減少［16-17］。這一結果可能的機制是：（1）在宮頸癌組織中輔助細胞數(shù)量減少，不僅分泌的細胞因子減少，導致對腫瘤細胞的殺傷減少；而且影響ILC3 細胞對腫瘤細胞的識別，導致ILC3 對腫瘤細胞的殺傷減少；（2）腫瘤免疫微環(huán)境中存在免疫逃逸現(xiàn)象。腫瘤浸潤的調(diào)節(jié)性T 細胞可以抑制特異性免疫反應，不僅促進腫瘤細胞的生長，而且間接抑制ILC3 細胞的活性［18］。

總之，ILC3 細胞數(shù)量在CIN 組織中是降低的,表明宮頸病變患者局部免疫功能下降，因此機體清除病毒功能減弱，導致癌癥。BV 的感染，pH值的改變導致陰道微環(huán)境失衡，ILC3 細胞數(shù)量減少，局部固有免疫功能降低，HPV 感染更容易發(fā)生，進一步加劇陰道微環(huán)境的破壞、免疫功能的下降，增加了CIN 的發(fā)生及進展，最終導致宮頸癌的發(fā)生。該研究為CIN 的發(fā)病機制提供了新的研究方向。