獻血者因素對保存期間紅細胞溶血的影響

何博 蘇瑋 梁雪開 歐陽劍 戚艷萍 黃曉斌

1廣州血液中心（廣州510095）；2廣州市醫學重點實驗室（血液安全重點實驗室）（廣州510095）

安全有效地儲存紅細胞（erythrocyte/red blood cell，RBC）是近一個世紀以來輸血治療的核心［1］。盡管開發出系統的存儲解決方案和介質［2］，RBC的存儲已取得顯著進步，但RBC 的存儲病變仍然是血庫的主要問題。影響RBC儲存病變的因素，包括儲存時間，血液成分制造方法和獻血者因素［3］。目前多數研究側重于前兩個，對于獻血者的個體差異對儲存RBC 的影響研究極少。有研究［4］表明，獻血者具有遺傳多樣性，對紅細胞儲存和輸血效果具有潛在影響。雖然這種遺傳差異的臨床效果尚未確立，但在動物實驗已經證明［5］。除遺傳背景外，獻血者性別已被證明會影響紅細胞儲存溶血和相關指標［6］。有研究［7］表明，來自男性的紅細胞在冷藏保存后表現出應激誘導溶血的易感性增加，睪酮參與此機制。最近一項觀察性研究顯示女性和年輕獻血者增加了輸血后死亡風險［8］。為了進一步探究獻血者在儲存期間溶血易感性方面的差異，本研究納入獻血者因素，性別，年齡和民族對自發的儲存溶血的影響。

調節儲存紅細胞質量的標準之一是測量儲存期間的溶血程度。溶血被認為是RBC 儲存質量改變的結果，出現溶血反應出對儲存條件的耐受性較差［9］。本研究系統性的納入儲存溶血和滲透性溶血、氧化應激溶血的反應情況，反應獻血者因素對儲存期間的紅細胞保存質量的潛在影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性收集2016年12月至2018年12月期間4 312 名獻血者，98.3%（4 239）的紅細胞用于儲存溶血參數檢測。所有獻血者均按照身份證資料或者自行報告民族、年齡、性別。其余例數及數量極少獻血者被歸為“其他”。

1.2 血液成分制備和樣品收集使用血站標準操作規程采集全血，離心分離血液成分［10］。紅細胞懸液保存在專用冰箱中，溫度在（4±2）℃。按無菌接駁從血袋中抽取15 mL 樣本置于無菌離心管中，保存32 ～35 d 用于研究。從離心管中取2 份（各1 mL）進行溶血檢測，其中1 份自發儲存溶血和滲透性溶血，1 份氧化應激溶血。

1.3 溶血檢測血細胞比容（壓積）、總血紅蛋白濃度測定嚴格按照試劑說明書、操作規程執行［11］。紅細胞2 000 r/min 離心5 min，測定上清液中血紅蛋白（Hemoglobin，HGB/Hb）含量。（1）儲存終點溶血率（%）=（1-血細胞比容）×血漿或上清液游離血紅蛋白濃度/總血紅蛋白濃度×100%。（2）紅細胞滲透脆性試驗溶血率（%）=上清液中Hb 濃度/總血紅蛋白濃度×100%。（3）氧化應激溶血率（%）=（OD值樣品PBS 溶液-OD值純PBS 溶液）/OD值樣品去離子水-OD值純去離子水）×100%。800 μL 紅細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成6.25%的紅細胞懸液，加入終濃度為50 mmol/L 偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2，2'-azobis［2-methylpropionamidine］dihydrochlo?ride，AAPH），37 ℃恒溫水浴鍋中孵育120 min，取50 μL 樣品溶液，用酶標儀檢測誘導樣品的上清液中血紅蛋白在540 nm 處的吸光度值（OD值）。樣品在去離子水中完全溶血時所釋放的血紅蛋白在540 nm 處的吸光度值（OD值）作為基礎值。

1.4 統計學方法用SPSS 19.0進行統計檢驗以確定各組差異，定量資料的結果表示為均值±標準差，以P＜0.05 為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 獻血者基本情況4 239 名獻血者（不包括多次獻血者）性別，年齡和民族分布情況見表1。

表1 獻血者基本情況Tab.1 basic situation of blood donor ±s

表1 獻血者基本情況Tab.1 basic situation of blood donor ±s

民族漢族壯族瑤族回族其他男性（例）1 849 126 138 181 98女性（例）1 496 105 125 135 86男性年齡（歲）35.6±16.0 38.6±13.4 40.7±15.2 34.7±13.2 35.7±14.5女性年齡（歲）37.5±15.7 37.5±13.4 39.5±15.3 36.5±12.3 37.8±14.1

2.2 性別對溶血的影響在保存32 ～35 d 時，儲存溶血率平均為（0.37 ± 0.31）%，性別因素在儲存溶血（男性0.42%vs.女性0.34%，P< 0.001）和滲透性溶血（男性30.4%vs.女性26.0%，P< 0.001）有顯著差異，氧化應激溶血率差異也有統計學意義（P=0.003），見表2。

表2 性別對溶血的影響Tab.2 Effect of the gender on the hemolysis x±s

2.3 民族對溶血的影響壯族、瑤族在儲存溶血率，滲透性溶血率與漢族差異存在統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 民族對溶血的影響Tab.3 Effect of the nation on the hemolysis

2.4 溶血相關因素的多變量分析獻血者的性別、年齡和民族的Logistic 多因素分析，發現儲存溶血和滲透性溶血與性別，壯族、瑤族以及年齡顯著相關。滲透性溶血中，性別、壯族、瑤族及年齡是獨立影響因素。氧化應激溶血傾向受到年齡、性別影響，見表4。

3 討論

隨著臨床用RBC日益增多，安全輸血制度也在逐漸完善，以提高輸血效果，減少輸血不良反應［12］。輸血醫學認為RBC 溶血是RBC 儲存損傷的標志［13］，因此當RBC 膜穩定性喪失和溶血時，輸注超過21 d 儲存期的紅細胞可能出現溶血不良反應［14］。

研究［15］表明獻血者民族多樣性影響冷藏保存RBC 自發性和誘導性溶血，存在獻血者紅細胞穩定性方面的差異。本研究中僅限于體外測量RBC溶血傾向，結果顯示男性和壯族與自發性或滲透性溶血關聯最強。與年輕人（年齡20 ～30 歲）相比，老年人（年齡50 ～75 歲）的紅細胞氧化應激水平升高，抗氧化活性受損［16］。老年人紅細胞中賦予對AAPH 氧化抗性的機制不太可能與性激素有關［17］，正如兩性中觀察到的類似趨勢所表明的那樣。多變量綜合分析后，儲存溶血、滲透性溶血、氧化應激溶血傾向與性別、年齡相關。最近的調查將年齡較大獻血者的紅細胞輸血與輸血后死亡風險降低聯系起來，這一結果可部分解釋以上結果［18］。

表4 溶血相關因素的多變量分析Tab.4 Multivariate analysis of factors related to hemolysis

不同民族間地中海貧血發生率也存在差異［19］。本研究在壯族、瑤族的獻血者和滲透性溶血中觀察到緊密關聯。壯族獻血者的紅細胞的滲透脆弱性可能源于壯族的獻血者中溶血性疾病（例如，鐮狀細胞病和地中海貧血）的遺傳性狀的高流行性，國內研究發現壯族和瑤族人群地中海貧血發生率高于漢族，已知其可減少滲透性溶血［20］。另外一項調查也顯示壯族人群α 地中海貧血發生率也高于漢族［21］，這些研究均表明不同民族間地中海貧血發生率也存在差異，因此導致紅細胞滲透脆弱性的差異。

基于多變量分析的結果，儲存溶血、滲透性溶血主要與獻血者民族相關，而氧化應激溶血傾向受獻血者年齡、性別影響。動物實驗中［22］，老年大鼠（24 個月大）與年輕大鼠（4 個月大）相比，紅細胞氧化應激水平效果更明顯。目前的研究結果強調氧化應激的作用，不僅存在于機體衰老中，而且存在于細胞衰老中［23］。由于氧化應激可能性隨著年齡的增長而增加，因此在年齡較大獻血者中觀察到的對AAPH 溶血抗性的增強可能與多次獻血史和其他與年齡相關的因素部分相關，這些因素導致紅細胞生成的鐵可用性降低［24］。

本研究儲存期末溶血率均< 0.8%，量化了獻血者情況對儲存的紅細胞中自發和應激誘導溶血的影響，并重點介紹紅細胞獻血者性狀與溶血可能的相互作用的見解。此類針對國內獻血員研究較少，盡管取得一定進展，但考慮到獻血員群體的龐大和不確定性，許多問題仍需要進一步研究，例如精確定義與輸血高傷害風險相關的溶血表型，以及可能易受年齡、民族以及哪些其他因素導致溶血傾向。當然，如上文所述，影響RBC 儲存病變的因素，包括儲存時間，血液成分制造方法和獻血者因素，還需持續本研究項目，期待進一步優化RBC 儲存和儲存病變的問題。另外，越來越多的研究關注溶血分子及遺傳機制［25-26］，期待從流行病學延伸到機制研究改善捐獻者篩選的過程，并減少溶血以及與輸血相關的傷害。總之，本項紅細胞儲存病變相關的獻血者背景和討論中代謝生物標志物也涉及到這一趨勢，對于溶血機制、優化紅細胞儲存條件和獻血政策具有參考價值。