激光削除1/3周透明帶對凍融單囊胚移植臨床結局的影響

周娜汝，金仁桃，盧芳汀，許波，李婧瑤，王玉瑞，祝心怡，童先宏

(中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院生殖與遺傳分院，合肥 230001)

隨著輔助生殖技術(ART)的日漸成熟和廣泛應用，醫(yī)源性多胎妊娠已成為ART治療不孕癥的一個嚴重并發(fā)癥，所以在保證成功率的同時能有效降低多胎率，行單囊胚移植成為了不孕患者的最理想選擇。

囊胚從透明帶中順利的孵出是胚胎著床所必需，有研究報道體外培養(yǎng)時間延長、胚胎冷凍和解凍等體外操作會導致透明帶硬化，使得囊胚不能從透明帶中孵出，最終無法順利完成著床[1-2]，而輔助孵化技術的應用可增加胚胎從透明帶順利孵出的機會[3-4]，提高臨床妊娠率。但也有研究報道認為輔助孵化并不能增加臨床妊娠率。這種研究結果的不一致性一方面在于研究背景不同，另一方面的共同特點是上述研究中的輔助孵化技術均采用了激光透明帶打孔或削薄[5-9]。激光透明帶打孔或削薄可能會造成囊胚孵出時嵌頓或透明帶開口不完全造成囊胚單卵雙胎或著床困難[10-12]。本文旨在研究激光削除1/3周透明帶對凍融單囊胚移植臨床結局的影響，為激光輔助孵化在臨床中的應用提供參考依據。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2018年5月至2019年3月在我院生殖中心行凍融單囊胚移植的688例周期患者的臨床資料。其中經355對夫婦(周期)知情同意后，對解凍后囊胚行激光削除1/3周透明帶輔助孵化后移植(LAH組)，其余333例周期患者囊胚解凍后未行激光輔助孵化移植(NLAH組)。納入標準：(1)移植日子宮內膜的厚度≥7 mm；(2)第5 天囊胚級別3 CB或3 BC及以上。排除標準：(1)反復種植失敗；(2)復發(fā)性流產病史；(3)輸卵管積水；(4)子宮腺肌癥、子宮內膜異位癥等疾病；(5)移植日子宮內膜<7 mm。

二、研究方法

1.促排卵方案和IVF培養(yǎng)：采用本中心常規(guī)長方案[13]方法促排卵，取卵、IVF及胚胎培養(yǎng)等按常規(guī)方案進行，第3天發(fā)育到6細胞及以上的Ⅰ級或Ⅱ級優(yōu)質胚胎，知情患者后，選取1～2枚胚胎移植或冷凍，后將剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，待養(yǎng)成囊胚后進行玻璃化冷凍保存[14]。

2.囊胚的分級：根據Gardner胚胎等級評分標準[15]，按照囊胚擴張程度和孵出情況、內細胞團、滋養(yǎng)外胚層細胞三個主要方面進行評分，根據囊腔的擴張孵化將囊胚分為1～6 期；根據內細胞團和滋養(yǎng)外胚層細胞的細胞數及細胞間緊密程度將內細胞團和滋養(yǎng)外胚層分為3級，即A 級、B 級、C 級。對分級在1期、2期或CC以上的第5天或者第6天囊胚行玻璃化冷凍。3 BB及以上定義為優(yōu)質囊胚。如有多個囊胚可供移植，一般選擇3期及以上囊胚進行移植。

3.囊胚冷凍：根據上述囊胚評分標準，適宜冷凍的囊胚逐個放置在囊胚液滴內，囊胚冷凍前需要先行激光輔助皺縮，選擇遠離內細胞團的滋養(yǎng)外胚層細胞連接處進行，皺縮孔徑8～12 μm，放回37℃ COOK三氣(6% CO2、5% O2、89% N2)培養(yǎng)箱內8～10 min，待其完全皺縮。采用玻璃化冷凍試劑盒(Kitazato，日本)對胚胎或囊胚進行玻璃化冷凍。冷凍步驟：將囊胚在平衡液中放置8～10 min，后立即轉移到玻璃化冷凍液中，并在1.5 min之內迅速裝載到冷凍載桿并投放到液氮中，裝好套管，保存于液氮中。

4.囊胚解凍：采用玻璃化解凍試劑盒(Kitazato，日本)對胚胎或囊胚進行玻璃化解凍。在解凍當日，將囊胚解凍液從冰箱取出，其中解凍液(TS)放置在37℃培養(yǎng)箱復溫15 min，稀釋液(DS)、洗滌液(WS1、WS2)常溫復溫。復溫后，將取0.5 ml TS液放置胚胎解凍皿-單孔中，放置37℃培養(yǎng)箱備用，依次取DS、WS1、WS2各0.3 ml置于胚胎解凍皿-三孔中常溫放置備用。解凍時，將載桿從液氮中取出，迅速甩動載桿，促使表面液氮揮發(fā)，再迅速置于37℃ TS液停留1 min，DS液停留3 min，WS1液停留5 min，WS2液停留1 min，均在室溫下操作。

5.透明帶削除輔助孵化：在解凍期間，當囊胚從DS液移至WS1液時，這時囊胚尚在鄒縮狀態(tài)，采用RI激光打孔儀。激光靶點定為到透明帶位置(遠離囊胚細胞團)，將激光脈沖持續(xù)時間調到400 μsec，沿著透明帶安全區(qū)域連續(xù)削掉1/3周長的透明帶(圖1A)，待WS1液平衡5 min后，將孵化后的囊胚轉移到WS2液，停留1 min，后將囊胚置于COOK三氣(6% CO2、5% O2、89% N2)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h等待移植，移植前于顯微鏡下觀察囊胚擴張情況并判斷其是否存活。存活囊胚在B超引導下進行移植。

A：凍融囊胚激光削除1/3周透明帶(箭頭示激光削除1/3周透明帶處)；B：未行激光削除凍融囊胚圖1 凍融囊胚透明帶示意圖(×45)

6.內膜準備、黃體支持和妊娠判斷：內膜準備采用自然周期或人工周期方案。自然周期方案是排卵后第5天移植單囊胚；人工周期方案是用戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4～8 mg，持續(xù)12～14 d左右，內膜厚度達到7 mm及以上，再聯(lián)合使用黃體酮(浙江仙琚制藥)肌肉注射及地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)口服，5 d后行單囊胚移植。胚胎移植12 d之后，血HCG≥50 U/L為陽性；HCG陽性者于移植后4周行超聲檢查，子宮腔內見孕囊和原始心管搏動為臨床妊娠；患者所選移植囊胚數均是一枚，一個孕囊中看到兩個胎心或是孕囊數超過移植的胚胎數為單卵雙胎；妊娠12周之內發(fā)生的流產為早期流產。

7.觀察指標：優(yōu)質囊胚率=優(yōu)質囊胚數/復蘇囊胚總數×100%；囊胚存活率=存活囊胚數/復蘇囊胚總數×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數/凍融囊胚移植周期數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/凍融囊胚移植周期數×100%；種植率=孕囊數/凍融囊胚移植數×100%；單卵雙胎率=單卵雙胎周期數/臨床妊娠周期數×100%；早期流產率=早期流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、兩組患者的一般資料

NLAH組患者年齡為25～45歲，平均年齡為(31.73±4.81)歲；LAH組患者年齡為26～45歲，平均年齡為(32.16±5.09)歲。兩組患者間年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、獲卵數、內膜厚度、不孕原因、優(yōu)質囊胚率、囊胚存活率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者的臨床結局比較

統(tǒng)計結果顯示，兩組患者的單卵雙胎率、早期流產率均無顯著性差異(P>0.05)；而LAH組的HCG陽性率、臨床妊娠率和種植率均顯著高于NLAH組(P<0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般資料比較[(-±s)，%]

表2 凍融單囊胚移植后妊娠結局的比較(%)

注：與NLAH組比較，*P<0.05

討 論

近幾年，隨著二胎的放開、高齡患者增加，在輔助生殖技術領域如何選擇胚胎進行移植，以降低醫(yī)源性多胎、提高妊娠率一直存有爭議。2018年中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會關于移植胚胎數的專家共識[16]中指出，對于預后良好的35～37歲女性，建議選擇性單胚胎移植，以降低多胎妊娠率和母嬰并發(fā)癥。而囊胚與卵裂胚相比，延長了體外培養(yǎng)時間，能在一定程度上對攜帶有遺傳缺陷或發(fā)育潛能低的胚胎進行淘汰，一般能發(fā)育到囊胚的胚胎具有更高的發(fā)育潛能，能提高臨床的種植率并獲得良好的妊娠結局[17]。此外，在臨床上，卵裂期胚胎形態(tài)學評分存在局限性，形態(tài)學評分為次級的胚胎往往也能發(fā)育到優(yōu)質囊胚[18]。隨著ART不斷發(fā)展，囊胚培養(yǎng)技術也在不斷改進和完善，這意味著囊胚培養(yǎng)能明顯提高臨床妊娠率和種植率。因此，行單囊胚移植成為了優(yōu)選方案。

透明帶可以維持卵母細胞和早期胚胎結構的完整性，但當胚胎發(fā)育到囊胚期，如果不能從透明帶中順利孵出，則會導致胚胎著床失敗。有研究表明，凍融胚胎后的透明帶結構發(fā)生變化，會導致胚胎透明帶變硬，增大了胚胎從透明帶中孵出的阻力[8]。因此，凍融囊胚移植前行輔助孵化逐漸成為常規(guī)操作。但由于機械法對操作者的技術要求很高，化學法對胚胎發(fā)育存在不安全性隱患，所以國內普遍使用激光透明帶打孔或削薄輔助孵化。

本研究中選擇激光削除囊胚透明帶1/3周長，臨床妊娠率、種植率分別為54.93%、56.06%；而囊胚未行激光削除透明帶周長的1/3，臨床妊娠率、種植率分別為為44.44%、45.35%，結果表明激光削除囊胚透明帶周長的1/3顯著提高移植成功率(P<0.05)。雖然不同的胚胎學者對囊胚的評分有一定主觀性，但兩組患者移植的優(yōu)勢囊胚率不存在顯著性差異，而且所移植囊胚均包含評分較低的囊胚。激光削除囊胚透明帶1/3周長組在HCG陽性率、臨床妊娠率和種植率都獲得了顯著的提高，但單卵雙胎率和早期流產率并無顯著性差異，這同Wan等[19]的研究結果相似。

激光輔助孵化雖然可以提高妊娠率和種植率，但可能也會增加單卵雙胎，單卵雙胎更易引起胎兒死亡和新生兒出生缺陷，增加母嬰風險[20]。但是本研究中并沒有提高單卵雙胎率，可能是因為本研究中激光削除透明帶周長的1/3、囊胚更易從透明帶中順利孵出的緣故。如果削除透明帶周長較短，囊胚可能被卡在其中，導致囊胚不能成功孵出或內細胞團分裂形成兩個獨立的胚胎，易發(fā)生單卵雙胎的概率。因此推斷，激光削除透明帶周長1/3時，可能并不會增加單卵雙胎的風險。另外，國內近期報道了激光輔助孵化完全去除透明帶后也取得了較好的臨床結局[21]，但目前國內對激光輔助孵化完全去除囊胚透明帶的臨床結局影響尚缺乏大樣本數據的支持。國外也有研究表明激光輔助孵化完全去除透明帶能夠提高移植成功率[22]，但對流產率的影響并沒有提及。

綜上所述，凍融單囊胚移植前行激光削除1/3周透明帶輔助孵化技術提高了臨床妊娠率，但不增加單卵雙胎率和早期流產率。所以凍融單囊胚移植前行激光削除1/3周透明帶，可以作為臨床上提高囊胚移植成功率的一個有效方法。但激光輔助孵化是否對活產率和新生兒的影響還需要收集更多的樣本，進行大力研究，以進一步了解激光輔助孵化與臨床結局的關系，更好的服務于患者。