環氧合酶-2在小鼠月經樣模型中對子宮內膜崩解剝脫的作用研究

張博男，陳西華，梁敏，劉婷婷，南楠，祝立權，張欣，汪坤，劉書言，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3.廣西醫科大學，南寧 450021)

月經是在子宮內分泌和旁分泌的影響下，子宮內膜為準備胚胎著床而經歷一個增殖、分化，在胚胎未植入情況下崩解脫落的循環[1]。月經發生機制復雜，有關月經的生理現象還有許多問題有待探索。1957年，Pickles[2]從人體月經液中提取出來一種刺激平滑肌的物質，即前列腺素(Prostaglandin，PG)。環氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是PGs的限速合成酶，可以催化花生四烯酸轉化為PGs[3]。COX存在2種亞型，分別是環氧合酶-1(COX-1)和環氧合酶-2(COX-2)[4]。與COX-1在許多組織中廣泛表達[5]不同的是，COX-2在如前列腺、輸卵管、卵巢和子宮等少數生殖組織中呈現高度誘導性表達[6-7]，且在生長因子或炎癥因子的刺激下，細胞中的COX-2也會被迅速誘導表達參與炎癥反應[8]。相關研究顯示，通過抑制COX-2的表達可以降低小鼠胚胎的著床率和妊娠率[9]，恒河猴和狒狒的COX-2在黃體期比在月經周期的增殖期表達更強烈[10-11]。此外，在人類中，COX-2在經前期子宮內膜中的表達強于排卵期[12]。這些研究提示，COX-2在月經發生過程中起到關鍵作用。

由于研究無法在人體內進行干預實驗，而月經發生過程只在少數物種中存在，因此月經和子宮不規則出血等相關機制的研究受到倫理道德與實驗物種的限制。小鼠月經樣模型的建立在一定程度上打破了這一限制條件。本研究通過建立孕酮(Progesterone)生理性撤退小鼠月經樣模型，使用COX-2特異性抑制劑Dup-697干預小鼠，探究COX-2蛋白在子宮內膜崩解時期的表達量變化以及COX-2在月經發生過程中的具體作用，為揭示月經發生機制提供線索，以及為臨床治療月經不規則出血提供理論依據。

材料與方法

一、研究對象

9～10周齡的SPFII級C57BL6雌性小鼠 40只，購自維通利華(實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006)。小鼠在可控的條件下給與充足的水和食物，光照時間8∶00～20∶00，溫度為20℃±1℃。所有實驗和外科手術都得到了國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會的批準。

二、研究方法

1.小鼠生理性月經樣模型的建立：依據前期研究結果建立小鼠生理性孕酮撤退月經樣模型[13-14](模型組，n=10)：小鼠摘除卵巢休息一周后記為第1天，在第1～3天 9∶00皮下注射100 ng 雌二醇(E2)，在第4～6天無處理，在第7天 9∶00 皮下注射5 ng E2和50 ng 孕酮，隨后將含有孕酮的皮埋管植于小鼠背部皮下；在第8～9天 9∶00繼續皮下注射5 ng E2。在第9天11∶30，向小鼠的雙側子宮角內注射15 μl無菌花生油以誘導子宮蛻膜化；在子宮蛻膜化49 h后去除孕酮皮埋管，記為取材0 h(圖1)。小鼠分別在孕酮撤退后0 h、8 h、12 h、16 h以及24 h處死，將雙側子宮固定于4%多聚甲醛或用液氮冷凍并于-80℃保存備用。

圖1 小鼠月經樣模型操作流程

2.COX-2蛋白的表達檢測：利用western blot方法分別檢測模型組小鼠子宮COX-2蛋白的表達量變化。首先，通過蛋白提取試劑盒(Invent Biotechnologies，美國)提取小鼠子宮組織蛋白并經BCA法(Thermo Scientific，美國)測定組織中的蛋白質濃度。蛋白總量50 μg上樣到10% SDS-PAGE進行凝膠電泳，隨后轉移至PVDF膜(Millipore，美國)，5%脫脂奶粉封閉后，分別與COX-2蛋白單抗(sc-19999，Santa Cruz，美國；1∶200稀釋)以及β-ACTIN多抗(60008-1-Ig，Proteintech，美國；1∶10 000稀釋)在4℃孵育過夜，與HRP標記的二抗(SA00001-1，Proteintech，美國；1∶5 000稀釋)進行蛋白免疫印跡反應，使用Gel Documentation And Image Analysis System(北京賽智創業科技)檢測蛋白條帶和定量分析。

3.COX-2抑制試驗及分組：根據是否進行COX-2特異性抑制劑Dup-697干預，將40只雌性小鼠分為2組：實驗組(Dup-697干預組，n=20)和對照組(n=20)。實驗組的干預方法根據前期研究[13]，在孕酮撤退的-6 h、0 h、6 h、12 h和18 h分別向實驗組小鼠腹腔注射劑量12.5 mg/kg的 COX-2特異性抑制劑Dup-697(Cayman，美國)，對照組小鼠在相同時間點腹腔注射等體積生理鹽水。小鼠分別在孕酮撤退后0 h、8 h、16 h以及24 h處死，將雙側子宮固定于4%多聚甲醛或用液氮冷凍并于-80℃保存備用。

4.石蠟組織切片HE染色：實驗組和對照組的小鼠子宮組織固定48 h后，制備常規石蠟切片。首先，將切片梯度水化，用蘇木素染液(珠海貝索生物)25℃染色2 min，使用1%鹽酸乙醇溶液分化2 s后浸入1%氨水中反藍40 s。隨后，用1%伊紅染液復染2 min(每次染色操作后用清水清洗3次)。梯度脫水后用中性樹膠(中杉金橋)封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

5.崩解面積計算：根據子宮內膜細胞的狀態判定子宮內膜的崩解區域與蛻膜化區域：蛻膜化區域細胞呈現細胞體積增大，細胞核增大變圓的狀態；崩解區域的細胞由于壞死而出現核固縮的現象。使用ImageJ軟件統計崩解面積與蛻膜化面積，子宮的相對崩解面積=崩解面積/蛻膜化面積×100%。

三、統計學分析

結 果

一、COX-2蛋白在小鼠月經樣模型子宮內膜崩解期的表達變化

Western blot結果顯示，月經樣小鼠孕酮撤退后，COX-2蛋白表達量在0 h表達量低，8 h開始升高，在12 h～24 h顯著提高(P<0.05)，并在24 h達到最高水平(P<0.05)(圖2)。COX-2的表達趨勢與子宮內膜破裂的進程一致，提示COX-2在小鼠子宮月經期可能具有重要調控作用。因此，針對COX-2進行了抑制干預實驗。

二、COX-2抑制劑Dup-697對月經樣模型小鼠子宮形態的影響

對照組小鼠子宮組織大體觀察顯示，孕酮撤退0 h、8 h、16 h、24 h子宮表面出血點逐漸增多，整體顏色逐漸加深，在24 h時呈現深紅色；而干預組小鼠子宮相較于對照組在同一時間點的出血點較少，并且整體顏色呈粉紅色，兩組之間的顏色差異程度隨著子宮崩解進程的加深而增大(圖3)。

三、COX-2對月經樣小鼠子宮內膜崩解面積的影響

小鼠子宮切片HE染色結果顯示，干預組小鼠子宮在整個月經崩解期大部分的蛻膜區域保持完整，僅在子宮內膜的蛻膜化區域存在少量的崩解(圖4)。統計結果顯示，在孕酮撤退后8 h、16 h、24 h子宮相對崩解面積分別為4.56%、8.19%和11.09%，而對照組在相應時間點的子宮相對崩解面積分別為16.79%、39.84%和90.85%，與對照組相比，干預組小鼠的子宮相對崩解面積顯著降低(P<0.01)。這些結果證明抑制COX-2在小鼠月經樣模型子宮內膜崩解過程中的表達可以降低子宮出血程度以及減少子宮內膜崩解面積。

A：western blot 電泳條帶；B：COX-2蛋白相對表達量；與0 h比較，*P<0.05圖2 COX-2蛋白在小鼠子宮月經崩解期的表達

A～D：對照組小鼠子宮0 h～24 h大體形態；E～H：干預組小鼠子宮0 h～24 h大體形態圖3 孕酮撤退后各個時間點實驗組和對照組小鼠子宮大體形態結果

A～D：對照組小鼠子宮0 h～24 h石蠟切片HE染色結果；E～H：干預組小鼠子宮0 h～24 h石蠟 切片HE染色結果。黃色虛線內代表子宮內膜崩解面積，紅色方框代表高倍圖像放大區域。 低倍圖像(×40)比例尺為200 μm，高倍圖像(×200)比例尺為50 μm圖4 孕酮撤退后各個時間點對照組和干預組小鼠HE染色結果

注：與對照組比較，*P<0.01圖5 孕酮撤退后對照組和干預組小鼠子宮 不同時間點的相對崩解面積

討 論

女性月經周期包含了子宮內膜的增殖、分化以及在未受孕的狀態下出現的崩解與出血等現象[1]。在臨床上，痛經、閉經、子宮異常出血等疾病的發生與月經過程聯系緊密。由于月經的發生機制復雜，因此探究和了解月經的發生機制對于治療子宮內膜相關疾病具有十分重要的意義。

本研究首先建立了月經樣模型小鼠。根據模型小鼠的western blot結果選取了在月經周期中表達量出現顯著差異的COX-2進行抑制干預試驗。Western blot結果顯示，COX-2蛋白表達量在孕酮撤退后8 h開始顯著上升，在24 h時達到最高水平，COX-2蛋白表達量在12 h～24 h顯著提高(P<0.01)。COX-2的表達趨勢與子宮內膜破裂的進程一致。另外已有研究表明，COX-2蛋白定位于子宮內膜崩解區域[15]，同樣提示COX-2在小鼠子宮月經崩解期中促進子宮內膜崩解剝脫。

COX-2在炎癥因子或生長因子刺激的細胞中可快速表達，參與細胞炎癥反應以及細胞生長、增殖等過程。COX-2具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，促進多種血管生成因子表達[16-17]的作用。在月經發生過程中，通過抑制COX-2在子宮內膜中的表達，可以干擾小鼠胚胎著床以及降低小鼠妊娠率[9]；近期研究表明[18]，COX-2的表達有利于胎盤的形成。同時COX-2在經前期子宮內膜中的表達強于排卵期[12]。這些研究結果提示COX-2在子宮月經期可能具有重要調控作用。

由于COX-2基因敲除小鼠在雌性生殖系統中存在許多缺陷，因此在小鼠月經樣模型中采用藥物干預的方法代替基因敲除技術抑制COX-2。Dup-697是一種COX-2特異性抑制劑，其對COX-2的抑制作用是COX-1作用的50余倍[19]。Dup-697能夠特異性結合COX-2第523位點的纈氨酸，阻斷COX-2與其疏水側袋的連接，從而抑制COX-2的活性[20]。因此使用Dup-697抑制COX-2的表達成為研究COX-2在子宮組織崩解以及其他女性生殖過程中作用的重要方法。

根據western blot所提示的結果，通過使用COX-2抑制劑Dup-697來研究COX-2在小鼠月經崩解期的作用。我們首先通過小鼠子宮大體形態評估小鼠子宮出血程度，判斷COX-2在小鼠子宮月經崩解期的作用。子宮組織取材結果表明，Dup-697干預組小鼠子宮組織顏色相較于對照組淺，且兩組之間的差異隨著子宮內膜崩解進程的推進而逐漸增大，這表明COX-2在小鼠月經崩解期可以有效調控子宮出血。

進一步分析COX-2抑制對子宮組織崩解的影響，我們通過HE染色對子宮組織形態學分析。結果顯示，在給予COX-2抑制劑(Dup-697)后，小鼠子宮內膜相對崩解面積顯著降低(P<0.01)，且干預組與對照組之間的差異可能隨著崩解進程的推進而增大。結果說明，COX-2在小鼠月經樣模型中參與子宮的內膜崩解剝脫。

月經是孕酮撤退誘導的生理性事件[1]。COX-2在人類[12]中以及本研究使用的小鼠月經樣模型中，均在月經早期被誘導激活。本研究中觀察到的COX-2在子宮內膜崩解過程中的誘導表達，提示了COX-2在子宮內膜崩解過程中起促進作用。但是，COX-2的抑制并不能完全抑制子宮內膜的崩解，其原因可能為其他信號通路共同參與調控了月經這一過程，需要進一步研究。

本實驗以小鼠月經樣模型為基礎，探究了COX-2在月經期子宮內膜崩解過程中起到的關鍵作用。這有助于我們更好的理解月經發生的復雜分子機制，選擇性COX-2抑制劑已用于治療臨床上的不規則子宮出血[21-24]，我們的研究將為子宮內膜異常出血的治療提供新的策略。