基于轉錄組數據的青蛤微衛星標記開發與驗證

方 軍，沈彥鵬，張雷雷，李騰騰，邵艷卿*

(1.浙江省海洋水產養殖研究所、浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室、 中國水產科學研究院海洋貝類工程技術研究中心，浙江 溫州 325005； 2.溫州醫科大學，浙江 溫州 325016)

青蛤(Cyclinasinensis) 俗稱環文蛤，隸屬雙殼綱、簾蛤目、簾蛤科，是我國一種重要養殖經濟貝類。隨著青蛤養殖方式多樣化、養殖技術不斷成熟，越來越多育種群體及家系被培育出來，為了避免由于常年人工養殖導致遺傳結構單一，同時也為保護青蛤自然種群不被人工多代繁育的養殖群體所污染，需要通過有效的分子手段評價種質資源和遺傳多樣性。然而有關青蛤微衛星標記十分有限，僅見董志國等(2011)通過磁珠富集法從基因組中開發SSR標記的報道[1]。目前迫切需要開發具有共顯性遺傳、多態性豐富、易于規?；瘷z測、檢測成本低等優勢的分子標記，以開展青蛤種群遺傳多樣性分析、遺傳育種等研究。

在眾多水生生物分子標記中，微衛星標記又稱簡單序列重復(Simple Sequence Repeat, SSR)，由1～6個核苷酸串聯重復片段構成，與其他分子標記相比，具有共顯性遺傳、高度多態雜合且穩定性好、易操作、檢測成本低等優點，目前已廣泛應用于系譜分析、遺傳圖譜構建、遺傳多樣性研究等多項領域。李煉星(2017)通過對選育的縊蟶(Sinonovaculaconstricta)后代進行微衛星分析[2]，結果表明連續6代在親本間有近親關系或者親本數量有限情況下，人工選育縊蟶苗種遺傳多樣性顯示明顯降低。連續累代群體選育工作使得縊蟶選育系的遺傳特性純化，可為后續選育工作中通過不同種群、家系間雜交或者增加親本數量來提高遺傳多樣性和生長性狀、耐病性、適應環境變化等目標性狀；韓學凱等(2015)利用509個微衛星標記構建了三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)覆蓋19個連鎖群[3]，1 940.3 cM(cM為厘摩爾根)的遺傳連鎖圖譜，為三角帆蚌分子標記輔助育種打下基礎?？梢娢⑿l星標記在海洋貝類遺傳育種方面應用之廣泛。

因此，本研究在通過轉錄組測序獲得生物學數據信息基礎上，拼接組裝獲得大量含SSR的EST(Expressed Sequence Tag)序列，并研究這些EST-SSR在青蛤EST中的分布特征，設計并合成部分引物，對浙江靈昆青蛤群體進行遺傳結構分析，以期為青蛤種質資源保護、遺傳多樣性評價等提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用青蛤60只，于2016年5月采自浙江省溫州靈昆，活體運回實驗室，解剖剪取閉殼肌及斧足，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 SSR序列的獲得及引物設計 根據青蛤cDNA文庫的IlluminaHiseq測序分析工作，利用MISA (Microsatellite Identification Tool)對基因轉錄本進行SSR檢測，找到SSR標記后，使用Primer3軟件完成SSR引物設計，參數均設為默認。隨機選取81條序列的引物送上海生工公司進行合成。

1.2.2 DNA制備、PCR反應及產物檢測 基因組DNA的提取參照海洋生物組織基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)的方法提取。

PCR反應體系為20μL∶1 μL模板DNA (30 ng/μL)，0.1 μL Taq酶(5 U/μL)，2 μL 10×PCR buffer (Mg2+plus)，1.6 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/μL )，0.4 μL正反引物對(10 μmol/L)，14.5 μL超純水。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min后，進入30個PCR循環：94 ℃變性45 s，復性45 s，72 ℃延伸45 s；最后72 ℃下延伸7 min，并將反應產物于4 ℃下保存。用1.5%瓊脂糖凝膠檢測擴增產物，鑒定有擴增產物后再用8%非變性聚丙烯酰胺膠電泳檢測，EB銀染、Bio-Rad Universal Hood II拍照。

1.2.3 多態性檢測及數據分析 根據電泳圖譜，參照引物設計時預期片段的大小統計條帶，采用POPGENE32軟件計算青蛤微衛星引物的期望雜合度(Expected Heterozygosity，He)、觀察雜合度(Observed Heterozygosity，Ho)、有效等位基因數(Effective Number of Allele，Ne)和哈代-溫伯格平衡值(Hardy-Weinberg Equilibrium，WE)。應用PIC-ALC軟件計算多態信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)。

2 結果與討論

2.1 青蛤SSR分布特點

利用MISA將去冗余后得到115 441條Unigene序列進行檢測得到SSR位點12 418個，主要為單核苷酸重復、三核苷酸重復和雙核苷酸重復。如圖1所示，單核苷酸重復數量最多，共有8 422個，占所有微衛星位點的67.82%，在單核苷酸重復的微衛星引物中，以A/T重復的引物最多，共有4 106個，占所有單核苷酸重復的48.75%，其次是三核苷酸重復，共有1 501個，占所有微衛星位點的12.09%。而其中重復單元為(TTG/AAC)n的位點數量最多，共有171個，占三核苷酸重復的微衛星總數的11.39%。雙核苷酸重復共有1 419個，占所有微衛星位點的11.43%，其中AT/TA重復的位點最多，共有721個，占雙核苷酸重復微衛星的50.81%。另外還有部分四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復以及混合型重復共1 076個，占所有SSR位點的8.66%。

圖1 青蛤 EST-SSR重復類型及所占比例Fig.1 Distribution of microsatellite sequences in the tested clam

2.2 青蛤SSR多態性引物篩選

利用Primer3軟件，設計了81對SSR引物，以8個靈昆青蛤的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，退火溫度上下波動5 ℃左右為梯度，對81對EST-SSR引物進行了初步篩選。研究發現擴增出穩定的可重復條帶的引物為48對，占引物總數的59.26%；通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合EB染色檢測，81對SSR引物中有27對表現出個體多態性，占引物總數的33.33%。多態性引物占有效引物的比例為56.25%。27對多態性引物中，11個雙核苷酸重復，4個三核苷酸重復，3個四核苷酸重復，2個五核苷酸重復，1個六核苷酸重復，5個混合型重復。27對引物序列等詳細信息如表1所示。

表1 青蛤27對微衛星引物序列及其參數Tab.1 Primer sequences and parameters of the 27 SSRs for C.sinensis

續表1

2.3 靈昆青蛤群體遺傳變異分析

用篩選出的27對微衛星引物對30只靈昆青蛤群體進行多態性檢測，圖2為引物CS83在青蛤中的擴增檢測結果。

圖2 引物CS83在青蛤30個個體中的擴增Fig.2 PCR results of EST-SSR primer CS83 amplified in 30 labelled clams 從左到右依次是M：50 bp DNA ladder marker，M1：DNA marker DL2000，1～30號個體樣品。

30個靈昆青蛤群體中，用27對引物擴增共獲得99個等位基因，每個位點產生等位基因數Na為2～6個，平均每個位點產生3.67個，其中CS78位點的等位基因數量最多(6個)；有效等位基因數Ne為1.03～4.89，所有位點大小在116～330 bp之間。青蛤靈昆群體的各遺傳參數見表2，觀測雜合度Ho為0.000 0～0.678 6，其中Ho￣值最高的是引物CS80，最低的是引物CS96。期望雜合度He為0.033 0～0.808 5，其中He值最高的是引物CS61，最低的是引物CS71。經過軟件分析，各位點遺傳多態信息含量PIC在0.032 3～ 0.764 5之間，最高的是引物CS83，最低的是引物CS71。除了CS71、CS78、CS80、CS85、CS90、CS91、CS94、CS104這8對引物之外其余均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)。

2.4 討論

目前，微衛星標記開發主要基于基因組文庫和轉錄組文庫，轉錄組微衛星標記EST-SSR和基因組來源的微衛星標記相比，具有種間通用性好，基因功能相關，開發成本低且周期短等優點[4]。在雙殼綱貝類中，已成功開發利用的微衛星標記有李云峰等(2010)通過對蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)外套膜和腎臟組織構建cDNA文庫進行的多態性EST-SSR篩選[5]；李紅蕾等(2003)使用RepeatMasker軟件在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的6 935條ESTs中發現了42條微衛星序列，并在設計的7對引物中發現有6對能夠產生擴增產物[6]；史松富等(2013)利用3 000條泥蚶(Tegillarcagranosa)單拷貝序列設計50條引物，得到24個多態性SSR位點等[7]。

表2 青蛤群體中各微衛星位點分析統計結果Tab.2 Statistical results of microsatellite loci in the tested clams

2.4.1 青蛤微衛星分布 本研究通過對浙江靈昆青蛤進行轉錄組測序，發現在青蛤轉錄組序列中單核苷酸重復的微衛星數量遠高于其他類型，其中A重復與T重復總量占所有微衛星數量的65.19%，這與王忠良等(2015)使用MISA軟件對馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)轉錄組測序數據分析得到的EST-SSR主要特征相吻合[8]。在多核苷酸重復微衛星中，三核苷酸重復(12.09%)略高于雙核苷酸重復(11.43%)；而四核苷酸(2.29%)、五核苷酸(0.16%)、六核苷酸重復(0.03%)三者都較雙核苷酸重復要少；此外還觀測到部分混合型重復微衛星(6.18%)。這種三核苷酸重復出現頻率較高的分布特征與泥蚶[9]以及三角帆蚌[10]類似。另外，在所有類型的微衛星中，A/T出現的頻率均高于C/G，這種分布特征同樣出現于紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[11]，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[12]等海洋動物的報道中，倪守勝等(2018)認為微衛星A/T含量高的原因可能是微衛星序列A/T含量高，則退火溫度Tm值降低，DNA鏈容易解開，通過DNA重組機制和復制滑動機制，產生富含AT重復類型的機率更高[13]。也有研究表明海洋生物在甲基轉移酶的催化下DNA中的GC兩個核苷酸胞嘧啶C被選擇性添加甲基，甲基化的胞嘧啶C很容易經過脫氨基作用突變成胸腺嘧啶T，在DNA復制及轉錄過程中使得G/C突變A/T，而少量的GC又是維持DNA熱力學穩定性所必需，因此微衛星序列中G/C含量遠遠不如A/T[14]。

2.4.2 微衛星位點多態性 經過PCR擴增以及聚丙烯酰胺凝膠電泳，自81對引物中篩選出27對多態性引物，多態性引物占33.33%。觀測雜合度Ho為0.000 0～0.678 6，期望雜合度He為0.033 0～0.808 5，平均觀測雜合度為0.292 9；平均期望雜合度為0.585 0。其中大部分位點的觀測雜合度低于期望雜合度，CS71觀測雜合度等于期望雜合度，只有CS80觀測雜合度高于期望雜合度。產生這個結果的可能原因之一是養殖群體經過多代人工繁育和近親繁殖使得雜合度顯著低于野生種群，這種情況普遍出現在養殖貝類群體中，如皺紋盤鮑(Haliotisdiscus)[15]、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)[16]等。另一個可能導致觀測雜合度低于期望雜合度的原因是未擴增的PCR無效等位基因的存在，因為未擴增的雜合子被作為純合子計算，導致該位點觀測到的雜合度低于實際情況[17]，這同時也可能是本實驗中多數位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)的原因。另外，牛東紅等(2010)認為微衛星位點多態性越高，等位基因數越多，則所需的樣本量也越大，當樣本量>30時，雜合度趨于穩定[18]；而魯翠云等(2008)通過對鏡鯉(Cyprinuscarpio)養殖群體樣本量和微衛星標記多態性水平之間的相關性分析認為當樣本量>40時，雜合度變動范圍變小，并出現平臺現象，得到當使用微衛星進行群體遺傳評估時，最適樣本量為40～50個的結論[19]。本實驗中所有的微衛星位點選取的樣本數均為30，為牛東紅等人認為的最小樣本量，小于魯翠云等人認為的最適樣本量，故而多數位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)也可能是由于樣本量不足所導致。

遺傳多態信息含量PIC指的是一個親本為雜合子，另一親本為不同基因型的概率，是一個多態性遺傳標記可提供信息量的度量。在本實驗中，遺傳多態信息含量PIC為0.032 3～ 0.764 5之間，平均遺傳多態信息含量為0.515 9。Bostein等(1980)提出，當PIC>0.50時，該位點屬于高度多態位點；當0.25

3 結論

本實驗利用青蛤的轉錄組數據，識別出大量微衛星位點，并成功篩選出27個青蛤多態性EST-SSR標記，其中19個為高度多態性位點。這些微衛星多態性位點的獲得，為進一步開展青蛤種質資源評估、群體遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等提供了新的有效分子標記。