豬TLR4基因SNP位點(diǎn)篩選及生物信息學(xué)分析

王馨敏，朱喬峰，馬 越，秦雅晶，李之昂，劉麗霞

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

Toll樣受體（TLRs）是動(dòng)物體中重要的模式識(shí)別受體，在免疫細(xì)胞表層，例如淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等廣泛存在[1]，在非免疫細(xì)胞，例如上皮細(xì)胞、牛胚氣管細(xì)胞等中具有較強(qiáng)的活性[2]。TLR4基因是20世紀(jì)末期才被發(fā)現(xiàn)的一種重要基因，屬于TLRs受體家族的成員，具有一型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)、跨膜區(qū)三個(gè)部分組成，胞外區(qū)具有大量的亮氨酸重復(fù)序列，組成了多肽鏈兩個(gè)末端之一的N端。TLR4是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）中比較典型的模式識(shí)別受體，在指導(dǎo)和編碼合成細(xì)胞壁外膜內(nèi)毒素成分時(shí)具有重要作用，與革蘭氏陰性菌感染的致病機(jī)理具有密切聯(lián)系。TLR4作為一種跨膜信號(hào)受體直接將脂多糖產(chǎn)生的刺激信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，是革蘭氏陰性菌及其脂多糖進(jìn)行宿主反應(yīng)的重要媒介，與各種炎癥因子基因的表達(dá)有關(guān)[3]。

豬作為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源之一在我國具有豐富的品種，具有遺傳性狀穩(wěn)定、對近交耐受性強(qiáng)、品種多等特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因突變會(huì)對受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用和機(jī)體的抗病性、易感性產(chǎn)生影響[4]。潘章源等[5]（2011）在進(jìn)行野豬和國內(nèi)10個(gè)地方豬品種TLR4外顯子1時(shí)，發(fā)現(xiàn)了高度保守的特征，不同品種豬基因外顯子1存在顯著差異。朱衛(wèi)華等[6]（2014）對安徽地方豬霍壽黑豬和引進(jìn)豬種長白豬TLR4基因進(jìn)行多態(tài)性分析，研究發(fā)現(xiàn)外顯子3具有一個(gè)突變位點(diǎn)，多態(tài)性在地方豬品種和引進(jìn)豬品種之間存在差異性。黃麗麗等[7]（2019）對海南五山豬TLR4基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該品種豬該基因的蛋白具有分泌性蛋白和跨膜蛋白，呈現(xiàn)親水性。TLR4基因具有較高保守性，但其變異會(huì)對受體的信號(hào)傳遞產(chǎn)生影響，與機(jī)體的易感性和疾病抗性有關(guān)。

本研究以大白豬、長白豬、杜洛克豬、八眉豬四個(gè)品種的豬作為實(shí)驗(yàn)開展的研究對象，實(shí)驗(yàn)過程中需要構(gòu)建DNA混合池，并對混合池結(jié)果進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過這種方式對產(chǎn)物進(jìn)行直接測序的方式對各種豬TLR4基因部分編碼區(qū)（Coding regions， CDS）的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析和篩選，還進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為TLR4基因易感性和疾病抗性的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采集樣本

從豬種豬場通過隨機(jī)抽樣的方法選取大白豬、長白豬、杜洛克豬和八眉豬各50頭，采集仔豬耳組織各約2 g，置于75%酒精中，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

采用試劑盒的方式提取不同樣品豬種的DNA，并在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行DNA樣品純度的檢測，并篩選提取效果良好的基因組DNA樣品構(gòu)建DNA混合池，即取50個(gè)DNA樣品進(jìn)行混合。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照G e n B a n k上公布的豬T L R 4基因序列（登錄號(hào)：A B 2 3 2 5 2 7.1），使用P r i m e r P r e m i e r 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。T L R 4基因的引物設(shè)計(jì)F:5′-CGTCATTAGTGCGTCAGTTCTC-3′R:5′-GAGCCGATGGTGTATCTTTGAG-3′，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 TLR4基因的PCR擴(kuò)增和測序

以DNA混合池為模板擴(kuò)增TLR4基因，摸索出最佳的擴(kuò)增體系及條件。

50個(gè)同品種的豬基因樣品各吸取1μl放入同一個(gè)離心管中構(gòu)建DNA混合池，把DNA混合池作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×Power Taq PCR Master Mix10μl，加ddH2O 7μl。

PCR反應(yīng)過程：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃30 s，退火58.1 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 50 s，循環(huán)30次；最后延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測，當(dāng)檢測結(jié)果良好時(shí)送生物技術(shù)服務(wù)公司純化后進(jìn)行雙向測序。

1.4 測序結(jié)果分析

利用Editseq和MEGA6.0等軟件將原基因序列與測序結(jié)果放在一起，進(jìn)行拼接和對比分析，對SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，并利用生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行序列特征分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用的生物信息學(xué)分析軟件

對TLR4基因片段CDS編碼產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí)重點(diǎn)分析：氨基酸序列、蛋白質(zhì)特性及功能結(jié)構(gòu)域等，需要應(yīng)用的工具軟件與網(wǎng)址見表1[8]。

表1 豬TLR4基因生物信息學(xué)主要分析軟件

2 結(jié)果分析

2.1 豬TLR4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及測序結(jié)果

通過PCR擴(kuò)增的方法對豬TLR4的基因片段進(jìn)行檢測，得到對應(yīng)片段的測序結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示引物的特異性良好，PCR產(chǎn)物只有一條條帶。基因片段的大小為353 bp，電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1）。

利用MEGA6軟件、BioEdit軟件將原基因序列與測序結(jié)果放在一起進(jìn)行拼接和對比分析，并篩選SNP位點(diǎn)，結(jié)果顯示豬TLR4基因片段中不含有SNP位點(diǎn)。

圖1 TLR4基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析和預(yù)測

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)包括蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、半衰期、等電點(diǎn)等，通過Bioedit及Lasergene7.1軟件對豬TLR4基因片段編碼蛋白質(zhì)理化特性進(jìn)行分析（見表2）。豬TLR4基因片段一共編碼118個(gè)氨基酸，纈氨酸（Val）最多，占整個(gè)氨基酸組成的12.7%，甲硫氨酸（Met）含量為0（見圖2）。豬TLR4基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為50.67，大于40，所以說明該基因編碼產(chǎn)物具有穩(wěn)定性。

表2 TLR4基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

圖2 20種氨基酸所占比例

2.3 豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測和分析

運(yùn)用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序?qū)ωiTLR4基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性進(jìn)行預(yù)測（見圖3），結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)第15位疏水性最強(qiáng)（2.811），第55位親水性最強(qiáng)（-2.867）。整個(gè)編碼產(chǎn)物中，親水氨基酸占39.84%，疏水氨基酸占60.16%，親水性平均值（GRAVY）為0.385，表明該基因編碼的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)疏水性，由此可推斷豬TLR4基因編碼的蛋白質(zhì)是一種不溶性蛋白質(zhì)。

圖3 豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性/親水性預(yù)測

2.4 豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

運(yùn)用在線程序（DNA fold web server 服務(wù)器）預(yù)測參考序列（登錄號(hào)：AB232527.1），對豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（見圖4）。運(yùn)用在線設(shè)計(jì)程序進(jìn)行同源建模，對蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示三級(jí)結(jié)構(gòu)也具有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符（見圖5）。

圖4 豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 豬TLR4基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

生物個(gè)體的表現(xiàn)形式由基因和外界環(huán)境共同決定[9]，進(jìn)行豬抗病性狀、生產(chǎn)性狀的研究具有重要意義，現(xiàn)階段受到商品化導(dǎo)向的影響，不同品種豬的抵抗力和體質(zhì)都在下降，致使一些與抗病性有關(guān)的等位基因出現(xiàn)丟失[10]。TLR4基因是一種與免疫系統(tǒng)有直接聯(lián)系的重要基因，研究表明基因多態(tài)性與動(dòng)物對病原的免疫能力有關(guān)[11]。近些年，開展不同品種豬TLR4基因研究工作的人越來越多，主要集中于抗病性、多態(tài)性和免疫方面[12-15]。劉筱等[16]在研究過程中發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白質(zhì)LRR（富含亮氨酸重復(fù)序列）功能域上的突變可能與豬種對疾病的易感性不同有關(guān)。王會(huì)敏等[17]對綿羊TLR4基因多態(tài)性與布魯氏菌病易感性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TLR4基因只有1 180 G/T位點(diǎn)可能與綿羊的布魯氏菌病易感性有關(guān)。基于模板的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測計(jì)算預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的重要方法是以模板為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，具有快速、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)[18,19]。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測時(shí)借助同源建模的在線設(shè)計(jì)軟件完成。

構(gòu)建DNA混合池進(jìn)行目的片段擴(kuò)增是一種簡單又直接的測序方法，可以發(fā)現(xiàn)基因的功能并指導(dǎo)抗病育種。本研究運(yùn)用DNA混合池對TLR4基因的2 912～3 240片段進(jìn)行擴(kuò)增，該區(qū)域中沒有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)。

在進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性預(yù)測和蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)基因片段一共編碼118個(gè)氨基酸，纈氨酸（Val）最多，甲硫氨酸（Met）最少，基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定大于40，說明基因編碼產(chǎn)物具有不穩(wěn)定性。編碼蛋白質(zhì)片段的親水性平均值（GRAVY）為0.385，說明該基因編碼的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)疏水性，所以豬TLR4基因片段編碼的蛋白質(zhì)是一種不溶性蛋白質(zhì)。進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測能夠反映出蛋白質(zhì)氨基酸序列與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為該基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究提供理論依據(jù)。現(xiàn)階段蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測在分子生物學(xué)的中心法則中還不能被合理的解釋，對蛋白質(zhì)具體功能的分析還需要進(jìn)行深入研究。