基于中國腦膠質(zhì)瘤基因組數(shù)據(jù)庫的STK3 基因在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后作用及臨床相關(guān)性分析

莊勝，花奇凱,2*，趙勁民*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧)

0 引言

神經(jīng)膠質(zhì)瘤，也稱為膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，幾乎占原發(fā)性惡性腦腫瘤的80%。它們來自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)上皮支持細(xì)胞。惡性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤具有彌散性和侵潤性生長的特點(diǎn)，同時(shí)具有極強(qiáng)的血管生成能力，再加上其對放療和化療的內(nèi)在抗性，導(dǎo)致了這些腫瘤治療困難[1]。盡管進(jìn)行了積極的手術(shù)，放療和化療，多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期仍然只維持在12-15 個(gè)月。因此，迫切需要開發(fā)新的預(yù)后生物標(biāo)記物和有效的治療靶向標(biāo)記物，以更好的對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層和更加科學(xué)的進(jìn)行治療選擇。

STK3，也稱為MST2，它的中文翻譯為絲氨酸/ 蘇氨酸激酶，在人類中是由蛋白編碼基因STK3 基因編碼的。STK3 是一種由促凋亡分子激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，表明其編碼的蛋白具有抑制生長的功能，它是河馬(Hippo) 信號通路中控制細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡的中央核心酶之一[2,3]。研究顯示，STK3 在腫瘤疾病中有重要作用，例如，STK3 可通過失活YAP 致癌基因來抑制肺癌和肝癌的的腫瘤發(fā)生[4-6]。在60 例肉瘤標(biāo)本中12 例(20%)檢測到MST2 啟動子甲基化[7]。然而，STK3 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用仍未闡明。

近年來，隨著組學(xué)、生物信息學(xué)的蓬勃發(fā)展，帶來了海量的腫瘤生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)，如基因，甲基化，蛋白質(zhì)組學(xué)，拷貝數(shù)等數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)的不斷出現(xiàn)，給腫瘤的診斷和治療迎來了新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇，也給廣大科研研究人員提供了大量公開的可利用的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究。

本研究通過中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(CGGA)的兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，研究了STK3 基因表達(dá)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響以及分析了STK3 基因與不同臨床特征之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

本研究是基于公共數(shù)據(jù)庫中國腦膠質(zhì)瘤癌癥基因圖譜計(jì)劃的數(shù)據(jù)的研究，在數(shù)據(jù)下載頁面，本研究下載了兩個(gè)獨(dú)立批次的神經(jīng)膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)，分別是mRNAseq693 數(shù)據(jù)集和mRNAseq325 數(shù)據(jù)集。另外還獲取了兩個(gè)數(shù)據(jù)集對應(yīng)的臨床信息。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

對同時(shí)包含有mRNA 測序信息和對應(yīng)完整臨床信息的病例予以保留，無mRNA 測序信息或?qū)?yīng)完整臨床信息的病例予以剔除。完整臨床信息包括：生存時(shí)間、生存狀態(tài)、性別、年齡、放療、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型共11 個(gè)變量。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)對兩個(gè)數(shù)據(jù)集處理后，mRNAseq693 數(shù)據(jù)集共納入489 例神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例，剔除204 例無完整臨床信息的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例；mRNAseq325 數(shù)據(jù)集共納入284 例神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例，剔除41 例無完整臨床信息的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例。分別將處理后的mRNAseq693 和mRNAseq325 數(shù)據(jù)集定義為：發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列。

1.3 基于STK3 基因的表達(dá)量進(jìn)行分組

目前，已發(fā)表文獻(xiàn)中，對于某基因的表達(dá)水平進(jìn)行分組最常用的截?cái)帱c(diǎn)是中位值。因此，我們以STK3 基因表達(dá)量的中位值作為截?cái)帱c(diǎn)進(jìn)行劃分，高于中位值的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例分為高表達(dá)組，低于中位值的病例分為低表達(dá)組。對STK3 高低表達(dá)組的病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Wilcoxon 秩和檢驗(yàn))并繪圖展示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究利用R 語言軟件(版本：v.3.5.0)完成所有的統(tǒng)計(jì)分析及相應(yīng)的圖片繪制。在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，采用非參數(shù)檢驗(yàn)——秩和檢驗(yàn)的方法：如Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)對STK3 基因高低表達(dá)組和其他9 個(gè)臨床變量(性別、年齡、放療、化療、IDH突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析STK3 基因與其他臨床病例參數(shù)的關(guān)系。采用K-M 生存分析和log-Rank 檢驗(yàn)比較STK3 基因高表達(dá)組和低表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例的預(yù)后。采用單因素COX 回歸分析和多因素COX 回歸分析明確STK3 基因是否是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者獨(dú)立的預(yù)后因素。采用接受者操作特性曲線(ROC)和曲線下面積(AUC)分析和評價(jià)STK3 基因作為預(yù)后因素的特異性和敏感性。上述統(tǒng)計(jì)分析在驗(yàn)證隊(duì)列中也進(jìn)行分析，以驗(yàn)證STK3 基因的作用是否一致。

1.5 基因集富集分析(GSEA)

基于STK3 基因的高低表達(dá)量，我們定義了STK3 基因高表達(dá)組和STK3 低表達(dá)組兩個(gè)表型。為了了解這兩個(gè)表型預(yù)后差異存在的可能原因，本研究利用基因集富集分析[8,9]，分析了高低表型在京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路上的富集情況。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的臨床特點(diǎn)

以下兩個(gè)三線表展示了發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床病理參數(shù)。

表1 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的臨床病理特征

表2 驗(yàn)證隊(duì)列的臨床病理特征

2.2 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中STK3 基因高低表達(dá)組的差異情況

本研究比較了在兩個(gè)不同的隊(duì)列中STK3 基因高低表達(dá)組的差異情況，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)隊(duì)列中，STK3 基因高低表達(dá)組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見圖1。

2.3 STK3 基因與臨床病例特征的關(guān)系

在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，STK3 基因與放療、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、組織學(xué)類型共6 個(gè)臨床病理特征相關(guān)(P＜0.05)；在驗(yàn)證隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，STK3 基因與年齡、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、組織學(xué)類型共6 個(gè)臨床病理特征相關(guān)(P＜0.05)。見圖2、3。

圖1 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中STK3 基因高低表達(dá)組的差異情況

圖2 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者STK3 基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖3 驗(yàn)證隊(duì)列中神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者STK3 基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖4 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的生存曲線

圖5

圖6 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的ROC 曲線

2.4 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列生存分析結(jié)果

在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中進(jìn)行K-M 生存分析，可以發(fā)現(xiàn)STK3 基因高低表達(dá)組具有顯著的預(yù)后差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-Rank 檢驗(yàn)，P＜0.05)。高表達(dá)組具有較差的預(yù)后，低表達(dá)組具有較好的預(yù)后。同樣，在驗(yàn)證隊(duì)列中可以觀察到同樣的現(xiàn)象。見圖4。

2.5 單因素及多因素COX 回歸分析

納入STK3 基因、性別、年齡、放療、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型共10 個(gè)變量進(jìn)行單因素和多因素COX 回歸。單因素COX 回歸結(jié)果顯示，在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，除性別和放療這兩個(gè)變量外，STK3 基因、年齡、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型共8 個(gè)變量與總生存率相關(guān)(P＜0.05)；在驗(yàn)證隊(duì)列中，除性別這一個(gè)變量外，STK3 基因、年齡、放療、化療、IDH 突變情況、1p19q丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型共8 個(gè)變量與總生存率相關(guān)(P＜0.05)。多因素COX 回歸結(jié)果顯示，在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，STK3 基因、年齡、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)共7 個(gè)因素是獨(dú)立的預(yù)后因素；在驗(yàn)證隊(duì)列中，STK3基因、化療、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型共6 個(gè)因素是獨(dú)立的預(yù)后因素。見圖5。

2.6 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列驗(yàn)證隊(duì)列的ROC 曲線及AUC 值

在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，STK3 基因的ROC 曲線及AUC 值顯示：1 年生 存 率AUC 值：0.612，3 年 生 存 率AUC 值：0.674，5 年 生 存 率AUC 值：0.692。在驗(yàn)證隊(duì)列中，STK3 基因的ROC 曲線及AUC 值顯示：1 年生存率AUC 值：0.629，3 年生存率AUC 值：0.726，5 年生存率AUC 值：0.780。見圖6。

2.7 基因集合富集分析

以發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為基準(zhǔn)文件進(jìn)行GSEA 分析，GSEA 富集分析結(jié)果顯示，STK3 高表達(dá)表型與低表達(dá)表型相比，高表達(dá)表型主要富集了癌癥相關(guān)通路以及自噬，白細(xì)胞遷徙等途徑。見圖7。

圖7 GSEA 富集分析結(jié)果

3 討論

本研究展示了基于人群的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者隊(duì)列中的STK3 基因的表達(dá)情況。STK3 基因低表達(dá)與更長的總生存率顯著相關(guān)。在對臨床病理參數(shù)(包括性別、年齡、放療、化療、IDH 突變情況、1p19q 丟失狀態(tài)、WHO 分級、復(fù)發(fā)狀態(tài)、組織學(xué)類型)進(jìn)行多變量調(diào)整后，可以發(fā)現(xiàn)STK3 基因表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的總生存率之間的關(guān)聯(lián)仍然很顯著。另外，驗(yàn)證隊(duì)列的分析同樣證實(shí)了上述結(jié)果。因此，STK3 基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)是獨(dú)立于當(dāng)前的預(yù)后因素的。

STK3 是一種存在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的蛋白激酶，能與多種腫瘤相關(guān)蛋白相互作用，研究表明，原癌基因產(chǎn)物RAF1 和STK3 相互作用能阻止STK3 自身的二聚化和磷酸化，因?yàn)镽AF1 可作用于STK3 的180 位蘇氨酸位點(diǎn)，而STK3 的完整活性需要同源二聚體結(jié)構(gòu)以及180 位蘇氨酸自身磷酸化。另外，STK3 可與NOREI，SAV1，RASSFI，NKX2-1 相互作用，可使STK3 發(fā)揮酶激活或磷酸化的功能[10-13]。STK3 在不同腫瘤類型中可發(fā)揮不同作用，一方面，STK3 可通過失活YAP 致癌基因來抑制肝癌和肺癌的腫瘤發(fā)生[4,5]；另一方面，有研究報(bào)道顯示，在急性白血病細(xì)胞系中，敲低STK3可導(dǎo)致導(dǎo)致急性白血病細(xì)胞系和原代細(xì)胞凋亡[14]。

目前還沒有研究探討STK3 與神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)患者之間在mRNA 水平上表達(dá)的STK3 差異很大，并且與預(yù)后密切相關(guān)。本研究表明，STK3 的表達(dá)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，這一結(jié)果可以在一組獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中得到驗(yàn)證。

基于基因集富集分析的方法為了解STK3 的假定功能和作用提供了一些有趣的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)然這些發(fā)現(xiàn)需要在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中加以證明。本研究發(fā)現(xiàn)STK3 似乎在以下領(lǐng)域發(fā)揮其主要功能：腫瘤相關(guān)通路途徑及過程。這也與STK3 目前文獻(xiàn)報(bào)道的功能相互吻合。

綜上所訴，本研究是描述STK3 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中預(yù)后作用的第一項(xiàng)研究。對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者而言，STK3 基因是一個(gè)有潛力的預(yù)后生物標(biāo)志物。然而，STK3 基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的功能作用仍有待進(jìn)一步研究。