甲亢患者鋅指蛋白A20 表達意義的探討

魏潔瓊，樊勇，萬尖尖，尚豐

(新疆醫科大學第一附屬醫院，新疆 烏魯木齊)

0 引言

甲狀腺功能亢進癥，簡稱甲亢，系指由多種原因導致的甲狀腺激素產生和分泌過多，引起的神經、循環、消化等多個系統興奮性增高和代謝亢進為主要表現的一種臨床綜合征。臨床以Graves病最常見，約占所有甲亢患者的85%。此文主要研究甲亢Graves病患者，多見于成年女性，男女比為1：4～1：6，以20-40 歲女性多見。Graves 病發病與自身免疫有關，屬于器官特異性自身免疫性疾病。其中引起甲狀腺功能亢進最重要的抗體是促甲狀腺素受體抗體(TRAb)，也稱TSH 結合抑制性免疫球蛋白[1]。A20，也稱為TNFAIP3(TNF α 誘導蛋白3)，參與對NF-κB 活化的負反饋調節。泛素編輯和NF-κB 抑制蛋白A20 的抗炎和免疫調節功能[2]。研究表明，A20 表達與多種炎癥及自身免疫性疾病有關。對A20 表達和/或功能研究對新的治療策略研究近年來成為熱點，而同樣作為自身免疫性疾病的甲亢，國內外文獻對A20 在甲亢發生發展的研究甚少。本實驗采用實時熒光定量 PCR，通過檢測30 例初發甲亢與30 例健康體檢者外周血鋅指蛋白A20 的表達，探討A20與甲亢的發生發展關系。以及A20 與TRAb 之間相關聯系，為進一步研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 對象

選擇2018 年10 月至2019 年5 月在我院內分泌科就診確診Graves 病患者30 例，均符合2008 年《中國甲狀腺疾病診治指南》。30 例中，男5 例，女25 例，平均(38.3±9.96)歲，年齡范圍在：20～60 歲。排除標準：(1) 已使用過抗甲狀腺藥物、131I 及手術治療病人；(2)使用免疫抑制劑、生物制劑、糖皮質激素類藥物等；(3)合并心、肝、腎及腦血管疾病，自身免疫性疾病及惡性腫瘤等。(4)近期有手術，感染、創傷及感染等應激情況，或處于妊娠期、哺乳期。采集同期我院健康體檢患者30 例作為對照組，男7 例，女23例，平均(40.20±12.27) 歲，年齡范圍在：20～67 歲。本研究方法患者或家屬知情并自愿參與。

1.2 研究方法

1.2.1 PBMCs 的提取抽取

將研究對象的空腹外周靜脈血3mL，加入相同體積的PBS，充分混合、稀釋血細胞。添加6mL 淋巴細胞分離液，室溫下，1500rpm 水平離心20 分鐘。離心后將第二層單個核細胞小心吸出加入到另一個離心管中。加入PBS 洗滌2 次。

1.2.2 Trizol 法提取PBMCs 中的RNA

向提取的PBMCs 中加入lmL Trizol 試劑，靜置10min。加氯仿200uL 劇烈震蕩15s，冰上放置10min。在4℃，12000rpm，離心15min，吸取三層里面最上層無色水相500uL 至新EP 管。加入500uL 異丙嗪混勻，室溫靜置10min，在4℃，12000rpm，離心10min。離心后在EP 管底的白色物質為RNA 沉淀。去上清液，將1mL 80% 乙醇加入EP 管，洗滌沉淀。室溫下，7500rpm，離心3min。去上清，靜置3min。向EP 管中添加30uL DEPC 水溶解，反復吹打。取少量己溶解好的RNA，使用蛋白核酸測定儀來測定提吸光度，計算OD260/OD280 評估純度。選用OD260/OD280 處于1.8-2.0，說明RNA 樣品純度好的標本。

1.2.3 逆轉錄反應

超凈臺內，將RNase Free 的PCR 管置于冰上，依次加入引物(Primer Oligo)1uL，5×Reaction buffer( 反 應 液)4uL，RNAase inhibitor(RNA 酶抑制劑)1 uL，10mm dNTP mix(10mm dNTP 混合液)2uL，RTase(RT 酶)1uL，RNA lug(V1=1/RNA 濃度)，無核酶水V2(V2=11-V1)。將加好樣的PCR 管置于漩渦振蕩器，離心備用。隨后將PCR 管置于PCR 儀里，按預設程序進行：42 ℃，60min，70℃5min，4℃保存。所得產物即為cDNA。

1.2.4 引物設計參考己發表過的文獻，實時熒光定量引物序列(5’-3’)：TNFAIP3F：CTGCTGGCTGCCTGTCTCAAG；T N F A I P 3 R：G T T C T G G A A C C T G G A C G C T G T G；H-bactin-F：TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG；H-b-actin-R：TCACCTTCACCGTTCCAGTTT。SYBR Green I 嵌合熒光法進行Real Time PCR，選用25uL 反應體系。按以下反應條件PCR 擴增：預變性95℃ 3min，PCR 95℃ 5s，40 個循環，退火/ 延伸60℃ 15s。結果以β-actin 作為內參計算目的基因mRNA，選用2-△△CT法對計算目的基因mRNA 實時熒光定量PCR 相對表達分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行分析處理，符合正態分布計量資料以表示，方差齊時采用獨立樣本t 檢驗。計數資料選列聯表檢驗。對兩參數相關性研究，采用Pearson 相關性分析比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象基本參數比較

甲亢組與健康體檢組的基礎資料，在年齡和性別之間無統計學差異，分別為：年齡(t=-0.659，P=0.513＞0.05)，性別(=0.417，P=0.519＞0.05)可對試驗數據進一步比較。見表1。

2.2 兩組間周血 PBMC 中鋅指蛋白 A20mRNA 水平比較

方差齊性滿足，采用兩獨立樣本t 檢驗：結果顯示健康體檢組中鋅指蛋白 A20mRNA 表達水平(1.20±0.35)比甲亢組外周血 PBMC 中鋅指蛋白 A20mRNA 表達水平(0.63±0.37) 明顯升高，t=-6.186，P=0.000，遠小于0.05，差異有統計學意義。見表1。

表1 研究對象臨床資料及實驗室檢測結果

2.3 甲亢組中相關性指標比較

采用Pearson 相關性分析比較鋅指蛋白A20mRNA 表達水平與其TRAb 關系，結果表明，甲亢組中外周血PBMC 中鋅指蛋白A20mRNA 表達水平與其TRAb 水平在統計學無明顯線性相關(r=-0.292，P=0.117)。

3 討論

Graves 病屬于自身免疫性甲狀腺疾病(AITD) 最主要的一種，除此之外還包括慢性淋巴細胞性甲狀腺炎和產后甲狀腺炎。AITD 的確切發病機制仍不清楚。有研究表明，它是B 細胞和T細胞介導的器官特異性內分泌自身免疫性疾病的一種，是由免疫耐受性喪失和對甲狀腺組織的自身免疫攻擊引起的[3]。越來越多的研究指出AITD 是一種多基因疾病，是各種易感基因和環境因素相互作用，共同影響著甲狀腺的細胞和體液的免疫反應[4,5]。

A20 是TNFAIP3 基因最重要的抗炎作用編碼蛋白，是由790個氨基酸殘基組成的泛素修飾酶其結構包含一個N 端卵巢腫瘤(OTU) 去泛素化酶(DUB) 域和七個C 端ZnF 基序。特殊結構可限制多個細胞內信號級聯反應。觸發免疫細胞活化的最佳表征分子途徑是經典的核因子-κB(NF-κB) 信號傳導途徑，該途徑導致眾多促炎性基因和細胞存活基因的轉錄。包括TNF，IL-1，LPS，T 細胞和B 細胞受體抗原等[2]。NF-κB 信號級聯受到泛素化的顯性調節，該過程可產生一系列翻譯后修飾，將蛋白質導向不同的生物命運[6]。泛素修飾酶A20 已成為一種強大且異常復雜的泛素依賴性信號調節劑。A20 受到NF-κB 依賴性信號的誘導，進而限制了NF-κB 途徑中幾種分子的信號傳導的持續時間和強度[7]。

與健康組織相比，在系統性紅斑狼瘡，類風濕關節炎[8]，強直性脊柱炎[9]，Behcet 病，成人Stills 病，炎癥性腸病以及牛皮癬等疾病中，外周血單個核細胞(PBMC) 的TNFAIP3mRNA 表達降低[10,11]。這一點在小鼠TNFAIP3 特異性表型模型上表明，A20 表達降低或缺失也可引起小鼠自發性炎癥和自身免疫性疾病。這種相關性表明增加A20 的表達和/或功能有可能是一種有前途的治療策略有利于患者獲得個體化治療[8]。

本研究結果表明，與健康健康者比較，甲亢患者組外周血PBMC 中鋅指蛋白A20mRNA 表達水平量低，這與以往在炎癥及其他自身炎癥疾病中實驗研究結論一致。可能表明低水平的A20，負反饋使核因子κB 通路活性增加。甲亢組患者A20mRNA表達水平與其甲狀腺自身抗體TRAb 水平呈負相關，但此研究因樣本量原因，無統計學意義。有研究表明TNFAIP3 基因可能是GD 的遺傳易感性因子[5]。與本研究結論在蛋白表達一致，說明A20 的低水平表達可能與甲亢發生發展有關。

綜上所述，A20 基因可能在甲亢Graves 病患者免疫應答中起到重要作用。A20 與TRAb 有相關性，表達減少或降低參與了甲亢的發生發展。A20mRNA 的水平可能是甲亢患者預后的潛在預測指標及潛在治療靶點。為進一步研究提供基礎資料。由于本研究樣本量較少，對TRAb 與A20 相關性研究，未達到預期結果，具有局限性。未對患者進一步炎癥因子，基因多樣性方面進行深入研究，具體機制尚有待進一步探討。進一步深入研究，可能為以后甲亢患者增加個體化治療方面獲益。