不同劑量rESWT 對幼兔膝脛骨骺板生長發育的影響

梁禮堪，劉小剛，龔飛，李建偉，黃建軍，唐慧淳，曹艷杰，張景春*

(1.山西中醫藥大學，山西 太原；2.山西省中醫院 骨關節科，山西 太原)

0 引言

ESWT 是一種經濟和無創的物理療法，廣泛用于骨肌疾病的治療，但是在骺板周圍疾病的治療鮮有報道。兒童和青少年的骺板比周圍組織結構更脆弱，如急性創傷及感染、腫瘤等原因均可對其造成不可逆轉的損害[1]，繼而導致肢體長度不等長、角度畸形或創傷性關節炎等并發癥，嚴重者還會導致肢體的殘疾[2]。為減少骺板損傷導致的相關并發癥，近年國外學者開展了ESWT 對骺板的相關實驗研究并證實高劑量的ESWT 對骺板不造成損傷，但只有高劑量，劑量覆蓋面相對狹窄[3,4]；國內專家不建議在兒科患者骺板周圍使用ESWT 進行治療[5]，但并沒有對其骺板附近相關疾病的治療缺乏實驗依據，也沒有對其安全范圍作出評估。本實驗通過觀察不同時間段低、中、高不同劑量rESWT 對幼齡家兔骺板影響，為確定ESWT 對骺板周圍治療的安全劑量提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

新 西 蘭 幼 兔18 只，雌 雄 各 半，8～10 周 齡，體 重800-1000g，購于太原康寶瑞實驗動物技術有限公司，生產許可證號：[SCXK( 晉)2019-0002]，這些幼兔均未達到骨骼成熟[6]。于山西省中醫藥研究院動物房喂養，控制溫度為23±2℃，濕度：40～70%，光照和黑暗周期為12 小時。適應性喂養三天后，按體重采用數字隨機量表分為低、中、高劑量組，每組3 只，雌雄不拘，單籠喂養，給予兔生長飼料，隔日飼喂富含維C 的蔬菜。

1.2 rESWT 沖擊處理

將幼兔固定在兔架上，用STORZ MEDICAL( 瑞士 MASTERPULS MP100) 對幼兔右膝脛骨內側沖擊，探頭參數：陶瓷探頭C15，沖擊前將沖擊部位毛發剃除，沖擊時未給麻醉處理，沖擊部位涂抹耦合劑( 亞達 江蘇華東醫療器械實業有限公司)，沖擊范圍的定位：以沖擊側膝關節間隙為標準向脛骨近端標出縱向1cm 的長度[7]，沖擊時不越過關節間隙及脛骨前正中線。所有幼兔沖擊由同一人操作，沖擊時左右移動探頭，避免長時間沖擊同一部位，且手持探頭壓力較低。分別于24 小時后(共沖擊1 次)、2 周(共沖擊3 次)、4 周(共沖擊5 次)分批處死幼兔。參照與人類相同治療劑量，設定治療參數：低(1bar)、中(2bar)、高(4bar) 三種劑量[8-9]，頻率：5Hz，沖擊次數：2000 次，療程：每周1 次。

1.3 指標檢測

1.3.1 雙側小腿外形及長度情況

沖擊后連續觀察3 天沖擊部位皮膚情況，每次沖擊前觀察沖擊部位是否腫脹及雙下肢外形有無畸形。小腿長度以股骨內髁及內踝尖為骨性標志，用軟尺測量股骨內髁及內踝尖的長度。測量時將幼兔固定在兔架上，安撫幼兔讓其放松，保證所測量下肢保持在伸直位，由三名操作者用軟尺分別三次測量雙側小腿長度，取其平均值。

1.3.2 膝關節脛骨近端骺板組織病理學觀察

對幼兔實施耳緣靜脈空氣栓塞處死后，將雙側膝關節脛骨近端骺板組織分離并取出，用游標卡尺測得取出軟組織厚度為0.2～0.3cm。將取出組織置于甲酸- 鹽酸混合脫鈣液中浸泡72小時，脫鈣后保證用細針穿刺時無阻力感。脫鈣后將組織固定在10%的甲醛溶液中。再行脫水、石蠟包埋、切片(5μm)和蘇木精-伊紅(HE)染色，包埋時將骺板矢狀位等份切成3 等份。用萬能熒光成像系統(BX51-DP72，日本 OLYMPUS)和ImageJ1.8.0 軟件分析和測量骺板、增殖層、肥厚層長度及沖擊側骺板的內、中、外側區域長度，三次測量取平均值。

1.4 統計學分析

用SPSS 22.0 軟件統計分析，統計方法為重復測量方差分析，P＞0.05 為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 雙下肢分析

2.1.1 沖擊后皮膚及外形

低、中、高三種劑量沖擊后出現皮下瘀斑，但未見皮膚破潰，瘀斑在72 小時后消退。24 小時、2 周、4 周與未沖擊的對照側相比，沖擊部位未見腫脹、畸形生長等異常改變。

2.1.2 雙側小腿長度變化

24 小時、2 周、4 周與未沖擊的對照側比較，沖擊24 小時、2 周、4 周后雙側小腿長度差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各時間段小腿長度變化(cm)

2.2 脛骨骺板病理學觀察

光鏡下觀察：100 倍顯示可見：低、中、高三種劑量沖擊24 小時、2 周、4 周后，相較于未沖擊的對照側，沖擊側骺板未見生長紊亂的細胞，且沖擊側骺板增殖層細胞數量較對照側增多，雙側鈣化層未見明顯改變，雙側骺板軟骨細胞柱呈直線生長，均未見彎曲生長，見圖1～18；400 倍顯示可見：低、中、高三種劑量沖擊24 小時、2 周、4 周后均未見細胞骺板軟骨細胞的細胞核固縮及核裂解，見圖19～21。采用ImageJ1.8.0 軟件分析和測量低、中、高三種劑量沖擊后幼兔雙側膝脛骨骺板、增殖層、肥厚層長度差異無統計學意義(P＞0.05)，且沖擊側骺板內、中、外區域外骺板長度差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2～4。

表2 各時間段骺板長度變化(um)

圖1 低劑量24 小時后右側骺板＊100

圖2 低劑量24 小時后左側骺板＊100

圖3 中劑量24 小時后右側骺板＊100

圖4 中劑量24 小時后左側骺板＊100

圖5 高劑量 24 小時后右側骺板＊100

圖6 高劑量 24 小時后左側骺板＊100

圖7 低劑量 2 周后右側骺板＊100

圖8 低劑量 2 周后左側骺板＊100

圖9 中劑量 2 周后右側骺板＊100

圖10 中劑量2 周后左側骺板＊100

圖11 高劑量2 周后右側骺板＊100

圖12 高劑量2 周后左側骺板＊100

圖13 低劑量4 周后右側骺板＊100

圖14 低劑量4 周后左側骺板＊100

圖15 中劑量4 周后右側骺板＊100

圖16 中劑量4 周后左側骺板＊100

圖17 高劑量4 周后右側骺板＊100

圖18 高劑量4 周后左側骺板＊100

圖19 低劑量 右側骺板＊400

圖20 中劑量 右側骺板＊400

圖21 高劑量 右側骺板＊400

表3 各時間段增殖層長度變化(um)

表4 各時間段肥厚層長度變化(um)

3 討論

根據波形，ESWT 有兩種類型，分別為fESWT 和rESWT[10]，rESWT 被認為是治療骨科疾病的一種有效方法，如：假性血栓、足底筋膜炎、肱骨外上髁炎、肩部鈣化性腱炎、跟腱疾病和股骨頭壞死[9]。近年來，因rESWT 是一種經濟、無創的物理療法，且臨床效果良好，其應用逐漸增加[11]。Nassenstein 等人[3]證明，在用人類相同治療條件下的ESWT，不會對幼兔表皮產生損傷。但本實驗研究中發現，低、中、高三種劑量rESWT 沖擊后所有幼兔均有不同程度的皮下淤血，但皮膚未見破潰，皮下淤血一般在72 小時消退。有研究表明[12]，ESWT 組織的副作用主要是由“空化效應”導致皮膚毛細血管的損傷，能量越高，血管管徑越小，損傷的可能性越大，本驗中幼兔的皮膚較薄，所以即使較低劑量也導致皮下淤血。

本實驗發現使用rESWT 低、中、高劑量沖擊后，幼兔雙側小腿長度差異無統計學意義，這與Kurzweil 等人[13]實驗研究結果相一致。然而，Yeaman 等人[14]則認為應用ESWT 于大鼠脛骨近端可導致其肢體生長遲緩。相關研究表明[15,16]，ESWT 對骺板損傷的機制可能與其直接沖擊效應及沖擊后血管損傷導致血液循環障礙有關。相關ESWT 基礎實驗指出[3]，沖擊波誘導細胞和組織效應取決于沖擊的次數和沖擊的能量，而本研究分別使用1bar、2bar、4bar 作為低、中、高劑量且沖擊次數為2000 次，相較而言，本實驗沖擊次數相對少且采用rESWT 進行沖擊，相較于其他實驗所使用的fESWT，rESWT 缺少fESWT 的典型陡變效應，rESWT 達到較低的能量密度，但處理面積更大[17]。Pazzaglia 等人[18]在對骺軟骨細胞研究中指出，軟骨細胞排列紊亂及細胞柱彎曲生長會影響骺板的生長發育乃至骨骼的生長，而本實驗使用低、中、高三種劑量rESWT 沖擊后，在100 倍光鏡下均未發現骺板軟骨細胞排列紊亂及骨橋的出現，低、中、高三種劑量在400 倍光鏡下均未發現骺板軟骨細胞的細胞核裂解及固縮，這說明本實驗所取rESWT 沖擊能量范圍及沖擊次數不造成骺板損傷。

哺乳動物長骨的縱向及橫向生長取決于骨的骺板。骺板中軟骨細胞按不同分化階段可分為靜止細胞層、增殖細胞層、肥大細胞層和鈣化層。其中增殖細胞層和肥大細胞層主要負責骨骼的增長[1]。本實驗發現低、中、高三種劑量沖擊后，沖擊側骺板增殖層細胞數量較未經沖擊的對照側明顯增多，提示沖擊側增殖層細胞的有絲分裂更為旺盛。ESWT 導致增殖層細胞分裂旺盛、數量增多的具體機制尚不清楚，可能與ESWT 刺激骺板端生成更多的血管有關，有利于骺板生長調節因子從周圍的血管運輸到骺板中[19]，從而有利于骺板軟骨細胞增殖。王克杰等人[20]報道了低劑量ESWT 對兔腱-骨結合部新生血管形成的影響，與對照組相比，低劑量ESWT 處理的肌腱具有更多的新血管和血管生成相關標記物。Ozturk[4]等人研究發現，高劑量fESWT 能刺激骺板的生長，但Saisu[21]等人用高劑量fESWT 沖擊家兔股骨出現過骨折結果，Johannes[22]等人通過fESWT 對懸浮細胞的研究表明低數量、高劑量的沖擊波更適合臨床的應用。本實驗選用低、中、高不同劑量rESWT 沖擊幼兔骺板，發現其不僅能刺激細胞增生，且未見骨折等并發癥，其原因是rESWT 作用較fESWT 更為緩和。本實驗雖未發現鈣化層的變化，但Saisu 等人[21]研究了ESWT 對未成熟兔長骨中骨礦物質含量的影響，表明了ESWT 誘導成骨細胞數量、密度增加，這有利于鈣化層細胞的骨化。

骺板生長過程中軟骨細胞需要不斷補充，Koji M 等人[23]研究表示骺板軟骨細胞由靜止區干細胞分化而來，這些細胞跨越整個生長板的增殖和肥大軟骨細胞的形成，本研究用rESWT 沖擊后增殖區細胞數量增多，其作用機制是否是促進靜止區干細胞的增殖，使更多干細胞分化為增殖層細胞有待于進一步研究驗證。

本研究中發現沖擊側骺板的內、中、外區域長度差異無統計學意義，這也從側面解釋了本實驗中幼兔沖擊側未見腫脹及下肢的畸形生長。

實驗表明在一定范圍內的能量rESWT 不會破壞骺板的生長，可使骺板增殖層軟骨細胞數量增多，雖骺板長度無變化，但骺板增殖層細胞數量的增多可能促進骨的縱向生長，但本實驗存在樣本量小、觀察時間短等不足，需要進一步更長周期的實驗研究。所以在將rESWT 應用于臨床小兒骨科實踐之前，還需進一步研究，以確定其對骨骺生長的最佳參數。