Wistar 大鼠膽管結扎型肝硬化模型的建立及肝組織病理學分析

王子航，王慧君，田全發

(內蒙古醫科大學附屬醫院 肝膽外科，內蒙古 呼和浩特)

0 引言

我國是肝硬化大國，肝硬化是各種致病因素長期或反復作用形成的彌漫性肝損害。國內研究者大多采用腹腔注射CCL4 或者二甲基硝胺以及硫代乙酰胺誘導肝硬化的形成，但由于其存在藥物毒性、價格昂貴及形成周期長等問題。因此，我們為了尋求一種安全，價格低廉，形成周期短并更適用于實驗操作的動物模型。通過國外文獻的學習，建立了大鼠膽管結扎致使膽汁淤積而造成肝細胞損害來誘導肝硬化形成的模型[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級雌性Wistar 大鼠，體重180～240g，由內蒙古大學動物實驗中心提供。所有大鼠隨機分籠飼養(6 只/籠)，于室溫及光照時間12 小時下自由攝食水，適應性飼養1 周后，分組實驗，實驗前12 小時禁食，不禁水，各項操作嚴格遵守動物實驗的倫理條例。

1.2 方法

雌性Wistar 大鼠隨機分為兩組，假手術組及模型組，每組30只。造模方法：術前禁食12 小時。模型組：大鼠5%水合氯醛按10mL/kg 腹腔麻醉后，仰臥手術臺，固定四肢，胸腹部去毛消毒，逐層沿腹正中線打開腹腔，沿十二指腸起始端找到膽總管(圖3)，游離膽總管并于距十二指腸0.5cm 及1cm 處結扎兩根絲線(3-0)，并于結扎線中間剪斷膽管，關腹[1]。假手術組：麻醉后打開腹腔，游離膽管，關腹。術后1 天糖水飼養，術后2 天，自由進食。于4，6，8 周為時間點行肝葉病理檢查及下腔靜脈取血肝功檢測。

1.3 觀測指標

(1)大鼠一般情況：大鼠皮毛光澤，食欲，活動、腹部變化及死亡情況；(2)3 時間點大鼠體重；(3)血清中的肝功能檢測，包括谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)；總膽紅素(T-BIL)以及直接膽紅素(D-BIL)：大鼠下腔靜脈采血，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測；(4)肝臟大體形態觀察及病理學檢測，取肝左外葉，多聚甲醛(4%)固定，石蠟包埋，切片。行HE 及Massion 染色，由病理醫生在不知道標本處于哪個時間點的情況下使用病理顯微鏡觀察肝臟病理改變。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0 統計學軟件處理數據，多組比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 建模成功率的統計

30 只膽管結扎大鼠中，建模成功24 只，死亡6 只，其建模成功率80%，死亡6 只均進行尸檢，2 只死于膽瘺，2 只死于急性肝損傷，2 只意外死亡。假手術組大鼠無死亡，正常存活8 周。

2.2 大鼠一般情況

觀察建模大鼠1-2 周間無明顯變化，4 周后毛發不順，飲食飲水稍減少，體重較前有所減輕。6 周后毛發凌亂無光澤，食欲差，精神萎靡活動少，外界刺激反應慢，眼耳尾部可見明顯黃染，體重增長緩慢(表1)。假手術組大鼠無明顯改變，體重逐漸增長。

2.3 大鼠肝臟外觀改變

假手術組的肝臟表面呈紅色，質地柔軟且富有彈性，無腹水。膽管結扎4 周后肝臟明顯腫大，質地較硬，呈黃褐色，膽管結扎處以上膽管增寬(圖1)。6 周大鼠肝臟表面可見細小顆粒狀結節，形成典型肝硬化外觀，肝臟黃褐色進一步加深，有腹水，膽管結扎處以上膽管增寬約10 倍，見圖2。8 周肝臟表面布滿顆粒狀結節，質硬，腹水較多( 圖4)。我們也制備12 周大鼠( 圖5)，大鼠膽管增寬明顯，淡黃色腹水大量，肝臟由黃變黑，質硬易出血，但大鼠存活困難，死亡率較高。

2.4 血清生化指標的變化

ALT 及AST 水平自4 周后開始檢測后呈逐漸升高趨勢，TBil及DBil 于BDL 術后4 周、6 周、8 周均呈現較高水平且隨時時間延長其指標無明顯變化(表2)。

表1 大鼠體重變化情況

表2 膽管結扎大鼠生化學指標變化

表2 膽管結扎大鼠生化學指標變化

組別 n ALT AST TBIL DBIL 4 周 8 80.38±4.27 350.63±22 88.25±6.53 94.63±3.16 6 周 8 74.5±3.74 301.75±11.85 87±9.79 95.63±3.28 8 周 8 72.8±2.69 300.75±9.98 87.86±7.66 95.25±6.65

圖1 示：箭頭指示4 周膽管結扎處明顯增大。

圖2 示：6 周大鼠肝臟外觀及膽管結扎處增寬約10 倍。

圖3 示：箭頭指示行膽管結扎術及正常大鼠膽管。

圖4 示：箭頭指示8 周膽管結扎以上膽管增寬；肝臟大致觀布滿呈顆粒狀結節，肝臟質硬，易出血，腸系膜及網膜靜脈曲張淤血。

2.5 大鼠肝組織病理學觀察結果

肝硬化組及假手術組的大鼠進行HE 染色，病理結果顯示：假手術組大鼠肝小葉結構完整，呈正常肝組織結構。隨著時間的延長，第4 周HE 染色的切片(圖6)中可見肝小葉結構輕微破壞，肝組織結構受損，肝細胞腫脹明顯，存在大量的脂肪變性并伴有炎性細胞浸潤，假小葉形成。第6 周HE 染色的切片( 圖7) 中可見肝小葉結構明顯破壞，肝細胞出現大片狀變形，壞死，出現大量炎性細胞浸潤并已形成典型假小葉。第8 周HE 染色(圖8)可見肝小葉被完全破壞，膠原增粗，大量的膠原纖維沉積于增生的膽管周圍，隨著膠原沉積加劇，肝硬化越來越嚴重，纖維面積增加，并出現彌漫性膽管增生，膽小管增生嚴重。

3 討論

圖5 示：箭頭指示為12 周膽管結扎術增寬的膽管；肝臟進一步由黃變黑，淡黃色腹水大量。

圖6 示：膽管結扎4 周后大鼠左外葉病理學切片

圖7 示：膽管結扎6 周后大鼠左外葉病理學切片

圖8 示：膽管結扎8 周后大鼠左外葉病理學切片

肝硬化是多種肝病反復作用的病理生理改變，我國是肝硬化大國，目前診斷肝硬化的金標準是肝穿刺病理學活檢，但穿刺活檢屬有創檢查[2-3]。血清學檢查由于不敏感或特異性低，仍被認為具有較大局限性[4-5]。這就體現對于肝硬化的基礎實驗研究是具有重要的科研價值。而建立有效的，適用于動物實驗的肝硬化模型是研究肝硬化的發生機制及進展過程的前提。綜合文獻中所提及多種的肝硬化造模方法，每種誘導肝硬化的機制不同，所造成的病理生化改變也不盡相同[6]。隨著肝損傷研究的不斷深入，選擇合適的動物模型顯得越來越重要。目前肝損傷的動物模型以大鼠，小鼠和大白兔為主，也有犬類和獼猴。根據病源可分為病毒性肝損傷，化學毒性肝損傷和膽道梗阻性肝損傷等，在本實驗之前的研究中，已建立較完善的四氯化碳制備豬肝硬化模型[7]，期間一直使用了最經典的動物模型之一，四氯化碳(CCL4)模型。隨著研究的不斷深入，前人已發現選藥物在不同的肝損傷模型中可能會出現不同的效果和作用機理[8]。因此，在本文中，為了研究膽道梗阻情況下的肝臟病理變化，我們選用了另外一種經典的動物模型，大鼠膽管結扎(BDL)模型。

文獻介紹最多的2 種方法即腹腔CCL4 注射和BDL 法建立肝硬化模型，這兩種大鼠肝硬化模型被認為是較理想的動物模型[9]。作者采用的BDL 法，大鼠膽管結扎肝硬化模型主要通過結扎大鼠肝部腹下方的總膽管(大鼠無膽囊)，引起梗阻部位以上膽管擴張、膽汁淤積、膽道內壓力增高，并可引發肝內膽小管擴張破裂，由于肝內血管受到擴張膽管的壓迫及膽汁外滲，肝細胞會發生缺血和壞死，膠原組織大量沉積，纖維組織大量增生并向膽管伸展，包圍肝小葉并散布于肝細胞周圍，隨著肝纖維化的加深，最終形成肝硬化[10-11]。我們對大鼠肝臟進行病理切片分析，BDL 后4 周大鼠肝組織鏡下可見肝細胞腫脹明顯并出現壞死，匯管區增大，膠原纖維沉積，此時肝小葉結構尚存，但存在大量的脂肪變性，此時假小葉形成。第6 周的切片中可見肝小葉結構被破壞明顯，出現明顯的膠原纖維增生，形成典型假小葉。第8 周鏡下可見彌漫性的肝小葉破壞，大量的膠原沉積在增生的膽管細胞周圍，膽小管增生嚴重，肝硬化加重明顯。通過對3 個時間點的肝組織病例分析，我們認為BDL 術后6 周即可形成肝硬化模型。通過病理HE 染色，6 周后的大鼠肝臟就已經形成典型的假小葉結構。BDL 法肝硬化模型組大鼠在術后早期即可見小膽管的明顯增生和炎細胞浸潤，晚期出現肝細胞變性壞死，且炎性細胞浸潤和纖維間隔同時存在。本實驗同時驗證了文章[6]的描述，本實驗BDL 法的肝硬化模型組大鼠血清TBil 和DBil 水平明顯升高，前已述及，BDL 肝纖維化模型是通過結扎膽總管而誘導的肝硬化模型，而同時TBil 及DBil是反映膽道梗阻情況的指標，故在術后4 周即達到高值并且后期無明顯變化。ALT 和AST 反映肝細胞損傷情況，與肝組織的炎癥程度有關，本實驗中BDL 法肝纖維化模型組早期ALT 和AST 即上升到高值，隨著時間的延長，ALT 及AST 逐漸升高，并呈高水平。

綜上，我們認為BDL 法制備大鼠肝硬化模型造模成功率較高，用時較短，其主要模擬的是急性肝損傷的過程，造模所用時間較短，肝細胞脂肪變性少，類型人的膽汁淤積性肝硬化[3]。但需要指出的是，結扎膽總管的方法死亡率較高，因其模擬肝臟急性損傷的過程，本實驗術后死亡2 例，考慮死亡原因為急性肝損傷致肝臟衰竭。同時我們發現急性肝損傷主要發生在膽管結扎后的第1 周內，在此過程中或之后及幾天中，動物會因此出現死亡。

通過病理學的分析，證實了BDL 法是可靠的建模方法，并且較系統的描述了4-8 周的肝組織病理學變化，著重描述了在病理切片中大鼠肝組織的發展進程。文獻中指出了在動物經歷過急性肝損傷后，在膽管結扎1 周后，肝臟出現肝纖維化，并且在第2周時纖維化到達一個平臺期，一直持續到第6 周[12]。我們可以從病理學的表現看出，BDL 法制備的肝硬化模型，4 周即有假小葉形成，6 周可出現典型的假小葉結構，此時我們認為肝硬化建模成功，當8 周后的肝硬化表現愈發明顯。但需要指出的是，BDL 法制備肝硬化模型病因其為模擬急性肝損傷，此時如再進行肝切除試驗或者其他手術試驗，可能會增加大鼠肝臟發生衰竭的幾率，我們今后可以通過建立成功的膽管結扎型肝硬化大鼠模型，研究肝硬化大鼠肝切除量與肝衰竭的關系，探討肝硬化大鼠肝臟切除量與肝衰竭的量化關系。