燈盞花素DSPE-PEG 聚合物膠束的制備及體外性質研究

顏寅萍，李霞，吳俊珠

(云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室(大理大學)，大理大學藥學與化學學院，云南 大理)

0 引言

燈盞細辛又名燈盞花、燈盞草，為菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬的干燥全草，以根或全草入藥，主要分布于我國西南地區，云南、廣西、湖南、貴州等地，用于治療頭痛、風濕痛、腦血管疾病引起的癱瘓；對高血壓、腦溢血、腦血栓形成、腦栓塞、多發性神經炎、慢性蛛網膜炎及其后遺癥具有較好療效，并對風濕病、冠心病也有一定療效[1,2]。燈盞花主要化學成分為黃酮類和黃酮苷類、芳香酸脂類、揮發性油類、咖啡酰類、單體化合物類等[3]。燈盞花素 (breviscapine) 為燈盞花的有效成分，是燈盞花中的一類總黃酮，內含燈盞花甲素和乙素，其中燈盞乙素占90% 以上。燈盞乙素(scutellarin) 又名野黃芩苷，是對心腦血管疾病起效的活性成分。燈盞乙素具有改善腦梗塞，增加腦血流量，降低血管阻力和抗血小板凝聚的作用；促進纖溶，具有良好的溶栓作用；臨床用于心腦血管疾病，如腦供血不足、腦出血所致后遺癥、急性腦梗死，缺血性腦卒中和冠心病等治療[4-7]。目前已經上市的燈盞花素制劑有口服制劑、注射劑，存在半衰期短、生物利用度低等問題[8]。

兩親性聚合物在水溶液中能自發形成聚合物膠束，親水性嵌段形成外殼，疏水性嵌段形成內核，在水中形成結構緊密的核-殼結構，可以包載脂溶性分子，具有良好的穩定性、體內緩慢釋藥，增加藥物的穩定性和提高生物利用度的作用[9]。王志玉等以DSPEPEG 2000 為載體材料制備多西紫杉醇膠束，所制備出來的膠束包封率高，24 h 累積釋放百分率小于30%[10]。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000) 是在體內可降解并經美國食品藥品管理局(FDA)批準的可用于人體的藥物載體材料，具有良好的生物相容性和安全性[11]。聚合物膠束作為納米遞藥系統可以達到緩釋及延長藥物作用時間的目的。本文以DSPE-PEG 2000 為載體材料，采用薄膜水化法將難溶性藥物燈盞花素制備成燈盞花素DSPE-PEG 聚合物膠束，對其包封率和體外釋放度進行研究，為后續開展體內研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ5200DB 型數控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)，TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計( 北京普析通用儀器有限責任公司)，HWS-24 電熱恒溫水浴鍋( 上海一恒科學儀器有限公司)，Agilent1200 高效液相色譜儀( 美國Agilent G1314B VWD 型紫外檢測器)，TGL-20B 離心機(上海安亭科學儀器廠)，Zetasizer Nano ZS90 粒度測定儀(英國 Malvern 公司)，JEM-2100F 型透射電鏡(日本電子)，LYZ 恒溫搖床(上海龍躍儀器設備有限公司)。

1.2 材料

燈盞花素標準品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號：Z17O7X22900)，燈盞花素原料藥(南京景竹生物科技有限公司)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000(1，2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000])(DSPE-PEG2000)( 西安瑞喜生物科技有限公司，純度≥95%)，色譜甲醇(利安隆博華醫藥化學有限公司)，其他試劑均為實驗室分析純級別。

2 方法

2.1 燈盞花素聚合物膠束的制備

采用薄膜水化法制備燈盞花素聚合物膠束，稱取20.0mg DSPE-PEG 2000 加入氯仿中，超聲溶解，稱取4.0mg 燈盞花素加入甲醇中，超聲溶解，將燈盞花素的甲醇溶液滴加到DSPE-PEG 2000 溶液中，氮氣下吹干，除盡有機溶劑，形成含藥脂膜，加入超純水8mL 后，通氮氣保護，37℃水合45min，室溫放置1h 后，將制得的膠束過φ0.22um 濾頭[12]。

2.2 燈盞花素聚合物膠束的表征

取一滴燈盞花素聚合物膠束滴于銅網上，空氣中放置10min，待干燥后滴加2% 的磷鎢酸溶液，放置5min，干燥后測定。用ZS90 型粒度測定儀測定膠束的粒徑、PDI 指數和zeta 電位。

2.3 波長的選擇

吸取適量燈盞花素溶液，放入棕色量瓶中，加入適量的甲醇溶液進行稀釋、定容至刻度線處，搖勻，配置成0.01mg/mL 的燈盞花素溶液，以甲醇為空白參比，用UV 法進行紫外吸收波長掃描來確定其最大吸收波長。吸取適量的DSPE-PEG2000 儲備液，用甲醇溶解稀釋，用UV 法進行紫外吸收波長掃描。

2.4 色譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18 (4.6×250mm，0.5 um)；流動相：( 甲醇：0.1% 磷酸溶液)。流速：0.8mL/min；檢測波長：335nm；柱溫 25℃；進樣量為10ul。

2.5 溶液的制備

0.1 mg/mL 的燈盞花素樣品溶液的制備：精密稱取1.0mg 的燈盞花素原料藥，放入10mL 棕色容量瓶中，加入適量甲醇溶液待其完全溶解后定容，制備0.1mg/mL 的燈盞花素樣品溶液。

0.1 mg/mL 的燈盞花素標準品溶液的制備：精密稱取1.0mg 的燈盞花素標準品，放入10mL 棕色容量瓶中，加入適量甲醇溶液待其完全溶解后定容，制備0.1mg/mL 的燈盞花素標準溶液。用甲醇溶液做為空白組，按照上述色譜條件，用HPLC 檢測。

2.6 標準曲線的建立

配制不同濃度的燈盞花素標準品溶液，濃度分別為4.0，6.0，8.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0，40.0ug/mL，按照HPLC 法在335nm 處對這一系列標準品溶液進行測定，得出這一系列標準品溶液的峰面積(S)，以峰面積值對質量濃度(C)進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.7 精密度及方法回收率考察

分別配制二組低、中、高(20.0、30.0、40.0ug/mL) 三種不同濃度的燈盞花素標準品溶液，每個濃度設置三個平行組，第一組標準品樣品進HPLC，考察回收率。第二組標準品樣品同一天內測定5次峰面積(S)，考察其日內精密度，計算RSD。同法，用上述第二組標準品樣品每天測定1 次連續測定3 天峰面積(S)，考察其日間精密度，計算RSD。

2.8 燈盞花素聚合物膠束中燈盞花素包封率的測定

采用微孔濾膜法測定藥物包封率：精密吸取過濾后的燈盞花素聚合物膠束，加甲醇破壞膠束，以4000 r/min 的速度離心10 min，取上清液至10 mL 容量瓶中，用流動相定容，φ0.22μm 微孔濾膜濾過，HPLC 法測定包封率。

2.9 釋放介質的選擇

燈盞花素溶液的穩定性隨溫度和pH 升高而降低，在進行體外釋放研究時，為了接近體內的生理條件，釋放介質的pH 選擇在7.4，溫度選擇在37℃。有研究表明一定濃度的EDTA-2Na 能明顯改善燈盞花素的穩定性[13]。最終選擇的緩沖介質為pH 7.4 的Tris-EDTA 緩沖液。

2.1 0 聚合物膠束的體外釋放實驗

分別取0.37mg/mL 的燈盞花素聚合物膠束及0.37mg/mL 的甲醇溶解的燈盞花素原料藥各2mL，分別放入預先處理好的透析袋中，每個樣品配置3 份。將透析袋分別放入20.0mL 釋放介質中，采用恒溫振蕩法，37℃水浴避光恒速100r/min 振搖，分別在0.083、0.17、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、12、24h，用移液槍精密吸取1mL 釋放介質，稀釋后采用HPLC 法測定，補充同溫等量的釋放介質。采用HPLC 法測定樣品的峰面積(S)，計算累計釋放率，繪制釋放曲線。

3 結果

3.1 燈盞花素聚合物膠束的表征

結果見表1 和圖1、圖2、圖3。燈盞花素聚合物膠束zeta 電位為-29.6mV。在TEM 觀察下呈形狀大小均勻的球形或類球形。

3.2 波長的選擇

分別取燈盞花素甲醇溶液和DSPE-PEG 2000 甲醇溶液進行紫外掃描，確定燈盞花素檢測波長，其結果見圖4。從圖4 結果顯示，燈盞花素在289nm 和335nm 都有顯著吸收峰，DSPE-PEG 2000 在289nm 波長處對燈盞花素有一定干擾，而在335nm 波長處幾乎沒有吸收。故選擇335nm 為含量測定的紫外吸收波長。

3.3 色譜條件

HPLC 結果見圖5。

3.4 標準曲線的建立

其 線 性 方 程 為：Y=13.77X+4.2819，R2=0.9995。 表 明 在4.0～40.0ug/mL 范圍內，峰面積(S) 和不同濃度(C) 的燈盞花素溶液之間存在著良好的線性關系。

3.5 精密度及方法回收率考察

日 內 精 密 度RSD 為0.50%，0.46%，0.17%，日 間 精 密 度RSD 為0.16%，0.05%，0.02%，平 均 回 收 率 為99.02%，98.80%，101.34%，RSD 分別為0.13%，0.10%，0.03%。RSD 值均小于3%，滿足含量測定的要求。

表1 燈盞花素聚合物膠束的表征

圖1 燈盞花素聚合物膠束的粒徑分布圖，a 空白膠束b 燈盞花素聚合物膠束

圖2 燈盞花素聚合物膠束的zeta 電位分布圖

圖3 燈盞花素聚合物膠束TEM 圖

圖4 燈盞花素和DSPE-PEG 2000 的UV 吸收光譜圖

圖5 HPLC 色譜圖 A：燈盞花素標準品，B：燈盞花素原料藥樣品，C：破乳后的燈盞花素

3.6 燈盞花素聚合物膠束中燈盞花素包封率的測定

結果見表2，燈盞花素/DSPE-PEG 2000 的包封率為(83.78±2.52)%，載藥量為(14.3±1.89)%(n=3)，且重復性和穩定性良好。

表2 燈盞花素聚合物膠束的包封率和載藥量

3.7 燈盞花素聚合物膠束的累積釋放曲線

結果如圖6，5h 時原料藥、載藥聚合物膠束的累積釋放百分率分別為86.76% 和57.89%。24h 時原料藥、載藥聚合物膠束的累積釋放百分率分別為100%和75.35%。結果提示，燈盞花素聚合物膠束具有一定的緩釋作用。

圖6 燈盞花素累計釋放百分率(n=3)

4 討論

本研究以DSPE-PEG 2000 為載體材料采用薄膜水化法制備燈盞花素聚合物膠束，對制備的燈盞花素膠束進行體外性質研究，聚合物膠束具有適宜的包封率。體外釋放實驗表明，燈盞花素聚合物膠束相對于燈盞花素原料藥具有一定的緩釋作用，可能對燈盞花素在血漿中的藥物濃度的維持具有幫助，本研究可為后續開展體內研究提供參考依據。