β變形菌多聚磷酸激酶PPK2 的原核表達及純化

閆東科,宮艷超,呂 平*,許鳳霞,李 冬,馬素靜

1.天津職業大學 生物與環境工程學院,天津 300350

2.天津渤海職業技術學院 環境與化工學院,天津 300402

變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多病原菌如β變形菌（綱）奈瑟菌屬腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟球菌分別是引起人類疾病細菌性腦膜炎和淋病的病原菌。系列多聚磷酸激酶ppk2基因的突變研究證實PPK2 與病原菌的發病機制有關。例如，下調ppk2基因可減慢結核分枝桿菌對巨噬細胞的侵入，敲除ppk2基因則可降低結核分枝桿菌在熱、酸和低氧應激下的存活[1]；經結核分枝桿菌ppk2突變株感染的豚鼠其組織病理學特征和細菌負荷均減少[2]；土拉熱弗朗西斯菌ppk2突變株對抗生素的敏感性升高且在巨噬細胞中表現出生長缺陷[3]。

ppk2基因在原核微生物體內廣泛存在。例如，在腦膜炎奈瑟菌血清B 群[4]、淋病奈瑟球菌、肺炎克雷伯菌、約氏不動桿菌、結核分枝桿菌、銅綠假單胞菌和霍亂弧菌等病原菌中均存在PPK2 同源物。但尚未在植物和后生動物（包括人類）中發現ppk2基因[5]。因而，靶向病原菌中多聚磷酸激酶PPK2 的新型抗生素開發被認為是一個理想的策略[2]。

本研究將圍繞β變形菌CB[6]中PPK2 同工酶（Gi_505233881，WP_015420983.1，以下簡稱：ΔPPK2）展開。首先，采用生物信息學方法預測ΔPPK2 蛋白的二級結構和基本理化性質；其次，利用物理轉化法將重組表達載體ΔPPK2/pET30a 轉入E.coliBL21（DE3）感受態細胞，IPTG 誘導ΔPPK2 蛋白試表達；最后，放大培養獲得的ΔPPK2 蛋白依次進行Ni-IDA 親和色譜柱、陰離子交換色譜柱和凝膠過濾色譜柱分離純化，以期獲得滿足蛋白質晶體學研究要求的ΔPPK2 蛋白，為后續的結構、功能研究和靶向ΔPPK2 蛋白的抗生素開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與材料 限制性核酸內切酶（NdeI、HindⅢ和ApaI）、SDS-PAGE Marker 和DNA Marker均購自美國Thermo 公司；Western blot Marker 購自德泰生物科技（南京）有限公司；質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術（上海）有限公司。另外，實驗以質粒pET30a 作為表達載體（卡那抗性，ΔPPK2 蛋白N 端僅含有6×His 標簽，純化過程中未切除），Δppk2目的基因由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要儀器與設備AKTA 蛋白純化儀、凝膠過濾色譜柱Superdex200 Increase10/300 GL、Ni-IDA親和柱和陰離子交換柱HitrapQ HP 1 mL 均購自美國GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學預測 利用PSIPRED 網站（http://web.expasy.org/protparam）預測ΔPPK2 蛋白的二級結構；利用ExPASy 網站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預測ΔPPK2 基本理化性質。

1.2.2 全質粒酶切和測序 利用限制性核酸內切酶ApaI和HindⅢ對重組表達質粒ΔPPK2/pET30a 進行全質粒酶切鑒定；目的基因Δppk2的測序工作由金維智生物科技有限公司完成。

1.2.3 ΔPPK2 蛋白試表達與鑒定 物理法轉化重組表達質粒ΔPPK2/pET30a 進入感受態細胞E.coliBL21（DE3），接種篩選出的單克隆到5 mL LB 液體培養基（含50 μg·mL-1卡那）中培養至OD600值為0.5～0.8 時，加入IPTG 使其終濃度為0.2 mM·L-1，并分別置于16 ℃、25 ℃、37 ℃條件下誘導ΔPPK2 蛋白表達。誘導后的菌液進行SDS-PAGE 電泳分析。基于電泳結果，通過Western blot 實驗進一步分析鑒定ΔPPK2 蛋白的表達情況。

1.2.4 ΔPPK2 蛋白的放大培養 根據上述試表達結果確定出最優誘導表達ΔPPK2 蛋白的溫度，采用培養3 L 菌液進行放大培養，誘導ΔPPK2 蛋白表達的時間一般為16～18 h。

1.2.5 Ni-IDA 親和層析純化 全菌采用50 mM·L-1Tris-HCl（pH8.5）、300 mM·L-1NaCl、20 mM·L-1咪唑含1%TritonX-100、1 mM·L-1PMSF 超聲裂解，采用咪唑緩沖液濃度梯度洗脫ΔPPK2，并收集每個洗脫組分進行SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.6 陰離子交換色譜和凝膠過濾色譜純化 首先，使用陰離子交換柱（HitrapQ HP）進行分離純化，根據出峰位置進行SDS-PAGE 電泳分析；然后，利用凝膠過濾色譜柱（Superdex200）進一步純化，根據出峰位置進行SDS-PAGE 電泳分析。ΔPPK2 蛋白經濃縮測定濃度后于-80 ℃冰箱內保存。

2 結果與分析

2.1 ΔPPK2 蛋白生物信息學預測

利用網站ExPASy 統計、分析ΔPPK2 蛋白的基本理化性質（如表1）。由ΔPPK2 的pI 值為5.69可知：在后續的分離純化過程中可選用pH8.5，50 mM·L-1Tris-HCl 緩沖液進行陰離子交換色譜分離純化；利用PSIPRED 網站預測ΔPPK2 蛋白的二級結構，ΔPPK2 不存在跨膜結構域和信號肽，應為胞內可溶性蛋白，且α螺旋和β折疊片層的分布較為均勻。

表1 ΔPPK2 基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of ΔPPK2

2.2 ΔPPK2/pET30a 全質粒酶切鑒定

ΔPPK2/pET30a 重組表達載體全長6180 bp，其中，Δppk2基因長903 bp。利用限制性核酸內切酶ApaI和HindⅢ進行全質粒酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在同一泳道上應有一個4216 bp 的條帶和一個1964 bp 的條帶。如圖1 與上述預期相符。

圖1 ΔPPK2/pET30a 重組表達載體的全質粒酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant expression vector PPK2/pET30a by restriction enzyme digestion

2.3 ΔPPK2 蛋白試表達與鑒定

試表達產生的ΔPPK2 蛋白N 端僅含有6×His 標簽，根據表1 中ΔPPK2 蛋白分子量預測結果，ΔPPK2 蛋白在SDS-PAGE 電泳時的分子量應約為35 ku。如圖2 與預期大小相一致，且16 ℃下誘導表達的ΔPPK2 蛋白表達量與狀態更為理想，后續放大培養階段選擇在16 ℃下進行。為進一步確定上述實驗結果，對16 ℃下的試表達菌液進行western blot 分析，結果顯示，抗ΔPPK2 蛋白N 端6×His標簽的抗體曝光位置同樣位于35 ku 處（如圖3）。

圖2 SDS-PAGE 分析ΔPPK2 蛋白試表達情況Fig.2 SDS-PAGE analysis of ΔPPK2 trial expression

圖3 Western blot 鑒定ΔPPK2 蛋白16 ℃下表達情況Fig.3 Western blot analysis of ΔPPK2 expression under 16 ℃

2.4 Ni-IDA 親和層析分離ΔPPK2 蛋白

將3 L 用于放大培養的表達菌液經IPTG 誘導、超聲破碎、離心后過Ni-IDA 親和色譜柱，SDS-PAGE 電泳分析不同濃度咪唑洗脫ΔPPK2 蛋白情況。如圖4，ΔPPK2 蛋白存在于全菌破菌離心后上清，蛋白可溶性良好，300 mM·L-1咪唑可充分洗脫ΔPPK2 蛋白，基本未發生“黏柱子現象”且蛋白純度較高。

圖4 ΔPPK2 過Ni-IDA 親和柱純化結果Fig.4 The purification result of ΔPPK2 via Ni-IDA affinity column

2.5 ΔPPK2 蛋白的純化

親和色譜洗脫下來的ΔPPK2 蛋白首先利用HitrapQ HP 陰離子交換柱進行純化，陰離子交換色譜圖（如圖5）呈現較對稱的單峰，說明ΔPPK2 蛋白帶電性質較為均一。吸取Q21-Q24 管洗脫液5 μL進行SDS-PAGE 電泳分析（如圖6）。ΔPPK2 蛋白在凝膠過濾色譜柱上的色譜圖呈現對稱單峰（如圖7），洗脫峰值出現在14.24 mL，說明ΔPPK2 蛋白在溶液中以單體形式存在。吸取D18-D23 管洗脫液5 μL 進行SDS-PAGE 電泳分析（如圖8），ΔPPK2 蛋白純度較高。將D18-D23 管洗脫液混勻濃縮至60 μL，測定蛋白濃度為12 mg·L-1，純度為95%。

圖5 ΔPPK2 蛋白的陰離子交換色譜純化Fig.5 The purification result of ΔPPK2 by anion exchange chromatography

圖6 SDS-PAGE 分析陰離子交換色譜純化ΔPPK2 蛋白Fig.6 SDS-PAGE result of ΔPPK2 purification by anion exchange chromatography

圖7 ΔPPK2 蛋白的凝膠色譜純化Fig.7 The purification result of ΔPPK2 by gel filtration chromatography

圖8 SDS-PAGE 分析凝膠色譜純化ΔPPK2 蛋白Fig.8 SDS-PAGE result of ΔPPK2 purification by gel filtration chromatography

3 討論

PPK2 在不同的微生物中以不同的寡（多）聚體（二聚體、四聚體和八聚體）存在，但具有相似的基本結構，均含有保守的分別與NTP 的β和γ位磷酸基團結合的Walker A 和Walker B 基序，而蓋子模序促進這些結合作用，并與Walker A/B 基序組成P-環NTP 水解酶結構域[7]。目前，針對病原菌中PPK2 活性的抑制劑（抗生素）研究主要基于PPK2 的寡（多）聚化進行。例如，G-四鏈體對結核分枝桿菌PPK2的八聚體復合物具有顯著抑制作用，且通過對霍亂弧菌PPK2和香港海鷗型菌PPK2的有效抑制表現出廣譜活性[8]。值得一提的是，紅色亞棲熱菌PPK2 和土拉熱弗朗西斯菌PPK2 與不同核苷酸底物的晶體結構表明[9]，對酶活性中心的阻礙作用或對發生底物轉移的蓋子區域的阻礙作用被認為是PPK2 靶向研究的新方向[10]，這就對PPK2 激酶的立體空間結構解析工作提出了要求。

本研究利用ΔPPK2/pET30a 重組表達載體，通過16 ℃，終濃度為0.2 mM·L-1IPTG 誘導ΔPPK2蛋白在E.coliBL21（DE3）中高效可溶性表達，依次通過Ni-IDA 親和色譜柱、陰離子交換色譜柱和凝膠過濾色譜柱進行分離純化，獲得了濃度為12 mg·mL-1，純度為95%的且具有高度均一性的ΔPPK2 蛋白。純化出的ΔPPK2 蛋白既可用于多聚磷酸激酶活性檢測和宿主細胞內相互作用蛋白的篩選，又可用于蛋白質晶體培養和X 射線蛋白晶體三維立體空間結構解析的科學研究，從而使靶向ΔPPK2 蛋白的新型致病菌抑制劑（抗生素）的開發成為可能。因此，本研究為深入研究ΔPPK2 蛋白的結構和功能奠定了實驗基礎。