糧油食品中微生物和真菌毒素污染預測模型研究進展

裴鵬鋼 熊 科 葉 宏 王小藝 趙峙堯 柳佳蕓 鄧 蕾

(北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心1,北京 100048)(北京工商大學北京市風味化學重點實驗室2,北京 100048)(北京工商大學北京市質量與安全重點實驗室3,北京 100048)(北京工商大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心4，北京 100048)

1 糧油食品預測微生物學

稻谷、小麥、大豆等大宗糧油食品是我國糧油食品加工的主要種類。而在這些糧油食品生產加工過程中，供應鏈環節鏈條長，各環節污染物種類多、來源復雜，致使糧油食品從原料種植到儲藏運輸等不同階段均易遭受微生物尤以霉菌及其產生毒素污染。迄今為止在糧油食品中已發現300多種真菌毒素，主要為黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素、展青霉素、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素等[1]。不同類型糧油食品中的產毒霉菌并非完全相同，即使同一種糧油食品中加工或儲藏不同階段或不同的環境條件下的有害菌也不盡相同[2]。

以小麥供應鏈主要環節為例，在其種植期間容易遭受赤霉病、葉銹病、紋枯病等真菌病害的侵染，造成小麥減產，并且產生的真菌毒素在小麥中形成積累；其次，在小麥原糧倉儲階段由于糧堆各部分貯藏溫度不同，再加上外界條件變化導致濕度變化使得小麥也極易遭受鐮刀菌、青霉菌、交聯孢菌及其次級代謝產物如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素(AFB1)的污染[3]。同時小麥制粉階段潤麥環節兩次潤麥處理，導致糧堆水分含量增加，潤麥倉倉儲環節為微生物的生長繁殖創造良好的條件。同時小麥粉在貯藏階段衛生狀況也會影響小麥粉中的微生物數量；在產品運輸環節，環境的差異同樣也會導致小麥粉霉菌等腐敗菌的數量增加。因此小麥供應鏈中存在真菌毒素污染物影響產品安全的較大風險，而對于供應鏈的污染物難以逐一進行分析研究，只能聚焦于關鍵階段對其進行控制分析。

預測食品微生物學(Predictive Food Microbiology)是結合微生物學、數學、統計學和計算機等學科，采用數學的方法描述微生物數量變化和外部環境因素之間的關系，并對微生物的生長動態情況做出預測。因此為了確保食品安全性，科學家們通過引入預測食品微生物學理論對食品中的微生物進行量化和行為預測。通過計算機軟件進行病原菌和腐敗菌生長及其產生的污染物在特定條件下的概率模型等的擬合[4]，快速判斷食品內主要病原菌和腐敗菌生長或殘存的動態變化以及有害物含量的高低，從而依據標準對特定階段食品的安全性作出快速評價。表1為近年來國內外對食品如玉米、水稻、麥芽等食品中的霉菌生長動力學模擬研究情況。

因此，針對糧油食品供應鏈污染物特點，采用預測微生物學模型的方式對其供應鏈中關鍵環節的毒素污染產生菌構建動力學模型以及通過不同條件下產毒概率模型，探究關鍵環節毒素變化及降解遷移規律，從而實現對糧油產品關鍵環節品質的安全評估與預測。通過模型的反饋來優化糧油產品貯藏及加工的方法和手段，實現“綠色儲糧”和“生態儲糧”，為確保糧油食品安全提供重要的理論依據。這也為未來開展糧油食品供應鏈真菌毒素污染的安全風險評估以及對其供應鏈中真菌毒素危害物預警追溯等奠定模型基礎，滿足糧油食品供應鏈安全與社會可持續性發展的需求。

表1 近年國內外關于食品霉菌生長動力學模擬情況

2 糧油食品中真菌毒素污染情況

國內目前大宗糧油食品真菌毒素污染超標問題嚴重，對消費者的身體健康帶來極大的安全隱患。稻谷、小麥、大豆、花生等大宗糧油食品中均發現真菌毒素不同程度污染的情況。

表2 近年國內糧油食品真菌毒素污染調查

注：ND指的是未檢出相應毒素。

3 微生物預測模型

微生物預測模型最早應用于食品貯藏階段細菌生長模型，同時期微生物學預測模型對霉菌并未有同等程度的關注研究，這與霉菌生長的量化復雜性有關。細菌裂變繁殖通常發生在食物表面或者液體基質而霉菌菌絲則可穿透食品的物理三維空間，所以對其定量分析更加復雜。并且產生有用且可靠的模型的先決條件必須是包含大量相關數據的數據庫，這對于研究真菌毒素來說無疑是巨大的挑戰。一般來說，微生物模型分為三類。初級模型是用來描述微生物在一定生長條件下其數量隨時間的變化關系，如孢子的萌發、菌株生長、菌體的失活等[22]。Zwietering等[23]比較了幾種S形函數(logistic，Gompertz，Richards，Schnute和Stannard)來描述細菌生長曲線，通過t檢驗、F檢驗發現Gompertz曲線10 ℃條件下植物乳桿菌數量隨時間變化的擬合度最高(見圖1)；而二級模型在一級模型的基礎上增加了環境因素，如：溫度、水分含量、pH等因素，表征環境條件的改變如何影響菌株的萌發和生長。圖2為評估水分活度為變量菌株徑向生長速率二級模型擬合圖；三級模型是一種軟件化模型，軟件包括了1個或者多個一級模型和二級模型，作為完整的預測工具為用戶提供服務[24]。

圖1 10 ℃生長的植物乳桿菌相對種群大小隨時間變化Gompertz曲線

圖2 22 ℃條件下模擬UG AF06菌株在全黑胡椒粒不同水分活度下菌株徑向最大生長率實測模型擬合圖

概率模型用于描述某一特定時間段某些事件發生的可能性，例如，特定條件下菌體是否生長、是否產生毒素。通過概率模型可以對某種食品基質在特定時間點的安全性做出快速評價[25]。

3.1 微生物生長初級模型

常用的一級模型主要有Logistic方程[25]、Gompertz模型[25]、Baranyi & Roberts模型[26]、Boltzmann模型[27]、致死模型[28]。

3.1.1 Logistic方程：

3.1.2 Gompertz模型：

y=a·exp[-exp(b-cx)]

式中兩個模型中的參數只是數學意義上的參數(a,b,c，…)，并不具有生物學意義，不能直接用于微生物生長曲線的擬合。需要對其中的參數進行修改，使用具有生物學意義的參數如(λ，μm，A)來代替純數學參數(a,b,c，…)。

修正后的Logistic模型：

修正后的Gompertz模型：

式中：μm為最大比生長速率，定義為生長曲線拐點處的斜率；λ為遲滯期時間，滯后期被定義為定義最大特定生長速率的線與時間軸的交點；t為培養時間；A指微生物數量達最大值；N0為初始孢子數；N為t時間后存活的孢子數量。Dantigny等[29]通過實驗比較Logistic模型和Gompertz模型，通過比較RMSE值(均方根誤差)發現兩者擬合優度類似，無法確定哪種模型在特定實驗條件下為首選，繼而通過評估其他標準如參數估計值的準確性來進一步判斷如：評估孢子萌發時間(50%孢子萌發所需時間)時，Logistic模型的精確度更高；而Gompertz模型可以更準確地估計遲滯期時間。

3.1.3 Boltzmann模型

3.1.4 Baranyi & Roberts模型

式中：μm為最大比生長速率(定義為拐點處生長曲線的斜率)(mm/d，μm/h)；λ為遲滯期時間；t為培養時間；A為微生物數量最大值。

Lo′pez等[30]評估微生物生長模型(光密度方法定量)確定包括真菌和細菌在內物種，采用包括Gompertz和Baranyi & Roberts模型在內的各種模型進行擬合，發現Baranyi & Roberts模型擬合度最高；Marin等[31]研究lineal模型、Gompertz模型及Baranyi & Roberts模型對14種常見食物腐敗真菌生長一級模型的適用性，采用菌落直徑進行生長速率表征發現：當所獲數據沒有發現漸進趨勢時，使用liner模型和Baranyi & Roberts模型可以更好地估計最大生長速率和遲滯期；當觀察到生長速率隨時間降低時，Baranyi & Roberts模型的擬合度更高。

3.1.5 致死模型

模擬溫度高低或致死劑濃度對微生物群體致死處理模型時，使用經典的一級方程對孢子滅活建立模型：

式中：N為孢子數；N0為初始孢子數；N(t)為經過處理后孢子數；ki為致死率/min-1。

現今大多數孢子滅活模型研究采用線性滅活方法，但是目前對于孢子滅活的研究還較少且只有少部分應用于真菌[32]。

3.2 微生物生長二級模型

二級模型主要有Ratkowsky平方根模型[32]、Arrhenius-Davey模型[33]、Rosso cardinal模型[34]、Polynomial模型[35]、Gamma Concept模型[36]。

3.2.1 Ratkowsky平方根模型

該模型最初是為細菌開發的。

式中：μm為最大比生長速率；b2、C2均為假定系數；Tmin2為最低生長溫度；Tmax2為最高生長溫度。通常該模型僅有溫度變量，Tassou等[37]在建立溫度和水分活度對合成葡萄汁培養基上希臘釀酒葡萄中2種產生赭曲霉A的炭曲霉菌株模型時，將Ratkowsky平方根模型變量拓展到其他變量因素上如水分活度。

3.2.2 修正的線性Arrhenius-Davey方程

最初用于描述溫度對細菌生長的影響，Panagou等[38]模擬溫度、pH和水分活度對從綠茶橄欖提取的紅曲霉生長速度影響時，將該模型變量因素延伸到pH和水分活度。

lnμmax=C0+C1/T+C2/T2

式中：μ為菌落生長速率；T為開氏溫度；C0、C1、C2為3個參數。

3.2.3 Rosso cardinal模型

Rosso等[34]在1993年提出了這個溫度模型，使用3個基本溫度(Tmin、Tmax、Topt)，和最佳溫度下的生長速率μopt。該模型是在經驗基礎上建立的作為描述數據的工具，模型的優點是所有參數都具有生理學意義，有利于對初始參數的估計。

μR(T,aw)=μopt·τ(T)·ρ(aw)

式中：μR為菌落徑向生長速率；μopt菌落直徑最大值；Tmin、Tmax、awmin為菌株可以生長的最低和最高溫度以及最小水分活度；Topt、awopt為菌落直徑達到最大值時對應的溫度和水分活度；awmax為1，方便計算無特殊意義。

3.2.4 Gibson模型

Gibson模型是第一個專門為霉菌開發的模型，Gibson等[35]發現真菌生長速率的對數與(1-aw)的平方根呈拋物線關系，所以將多項式模型應用于黃曲霉的生長。

式中：μ為菌落生長速率；a0、a1、a2為3個需要估計的參數。

Tassou等[39]研究環境溫度(25 ℃)和選定溫度(45、55 ℃)下的高靜水壓力對火腿中金黃色葡萄球菌的滅活動力學建模，在Gibson模型中增加溫度變量。

式中：a0、a1、a2、a3、a4、a5為3個需要估計的參數。

3.2.5 Gamma Concept模型

Gamma Concept模型由Zwietering等[36]提出，認為影響微生物生長速率的各種因素可以通過單獨效應的乘積來組合。使用這種方法的優點是，對于確定影響生長速率每個變量，可以通過分離各種變量的影響來計算相對效應。這個模型有一般形式：

其中給定變量的相對影響可以通過該變量的gamma因子來描述：

3.3 概率模型

當實驗目標是觀察在特定條件下微生物是否生長時，即可采用概率模型來進行擬合。概率模型在很多情況下可確保食物不受微生物污染至關重要，尤其適用于涉及病原微生物或者產毒微生物污染的情況。概率模型允許在各種條件下預測特定事件(例如微生物的生長和毒素的產生)是否可能發生，其中增長概率模型是根據特定時間點在整個實驗設計中“增長/無增長”響應的比例構建的[40]。

Logistic回歸模型是判斷菌株增長/無增長邊界的有用工具，將事件發生概率Y與條件變量進行關聯。

式中：xi為因子變量(T,aw,pH,…)；bi為要估計的常數。

4 糧油食品中的微生物預測模型的應用

現階段對于模型的應用大多集中在產品的儲藏階段：真菌的動力學模型、外界條件影響的二級模型、毒素積累模型以及產毒概率模型。目前人工模擬的儲藏實驗一般通過控制糧油食品儲藏環境中的溫度和濕度來控制微生物的生長以及毒素的產生。通過人工模擬儲藏實驗能對實際微生物的生長和產毒的情況進行準確預測，以達到預警的目的。對于產品的加工階段由于沒有合適的可控外界條件，因此目前加工階段關于模型的研究還較少。

4.1 儲藏階段動力學模型

小麥在儲藏中更易滋長霉菌，最容易感染嘔吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素[41]。彭堅等[42]以小麥為基質建立了黃曲霉在小麥貯藏階段的初級和二級模型，分別利用Gompertz模型、Logistic模型對黃曲霉在小麥中生長曲線進行擬合，通過t檢驗和F檢驗發現Gompertz模型擬合效果更好，符合黃曲霉生長規律。利用Ratkowsky方程擬合不同溫度下黃曲霉生長二級模型發現先R2相關性比較好, 達到0.99以上。

玉米是我國三大糧油食品品種之一，其在儲藏期間極易遭受灰綠曲霉和黃曲霉的污染[43]，短期內可能發生霉腐變質現象。岳曉禹等[44]進行溫度對儲藏玉米中霉菌生長動力學模型構建，以儲藏玉米霉菌為研究對象，在不同儲藏溫度、不同時間條件下用修正的Gompertz方程擬合腐敗霉菌的生長動力學模型，采用修正的線性Arrhenius-Davey方程和二階多項式方程擬合溫度對玉米中霉菌生長的比生長速率和遲滯期的影響，通過模型驗證表明修正的線性Arrhenius-Davey方程可以較好地描述、預測不同溫度對玉米中霉菌的比生長速率和遲滯期的影響。

房保海等[45]在不同溫度和相對濕度條件下對花生中的黃曲霉菌株生長特性進行測定，并采用Boltzmann 和Logistic模型對其生長曲線進行擬合，結果表明在適宜溫濕度條件花生黃曲霉生長曲線更適合用Boltzmann 模型擬合。

Yue等[46]在大米干燥過程對大米黃曲霉增長率和遲滯期影響的建模研究中，利用Baranyi & Roberts模型較好地擬合了黃曲霉在大米中的生長曲線，利用線性Arrhenius-Davey模型描述不同水分活度下黃曲霉生長速率和遲滯期，通過模型驗證具有較高的R2和較低的MSE值，模型具有良好的擬合度。利用二階多項式模型來擬合溫度和水分活度對生長率和遲滯期的共同作用，通過模型成功預測出該類大米中黃曲霉生長的最適溫度，對水稻的貯藏保鮮至關重要。

Mousa等[47]以拋光大米和糙米為基質，通過控制溫度和水分活度來對2種不同基質條件黃曲霉徑向生長速率和黃曲霉毒素的產生分別進行建模分析。通過Baranyi模型較好地擬合菌落半徑隨時間變化模型，利用線性Arrhenius-Davey模型和多項式模型擬合溫度和aw對黃曲霉生長速率的影響，并通過獨立的實驗數據對模型加以驗證，結果表明線性Arrhenius-Davey模型是拋光大米和糙米上黃曲霉生長速率的最佳預測模型，預測黃曲霉的最適生長溫度為30 ℃。

Marin等[48]研究溫度、濕度等外界條件對開心果貯藏的影響，人工模擬不同溫度、水分活度對開心果中的黃曲霉生長影響進行建模分析。利用Davey模型、Gibson模型、一般多項式模型、多因子cardinal模型和改進的cardinal模型五種方法評價黃曲霉徑向生長速率μR對環境的響應值。通過均方根誤差(RMSE值)判斷發現cardinal模型對黃曲霉的徑向生長速率擬合度較高。同時利用改進的cardinal模型(減少觀測實驗值數量)擬合的同時發現預測值更接近于觀測值，但因為存在偏差估計，r2只有0.67而多因素cardinal模型r2為0.78。改進的cardinal模型是基于減少的實驗觀測點開發的，從而使驗證步驟的預測煩瑣程度得到改善[49]。

4.2 菌株生長邊界模型及毒素積累預測模型

Battey等[50]利用Logistic回歸模型預測腐敗霉菌生長概率，以0、1進行賦值。0代表無霉菌生長，1代表有霉菌生長。發現pH、可滴定酸度、糖含量、苯甲酸鈉和山梨酸鉀水平都是影響霉菌隨時間存在生長可能性的重要因素。該Logistic回歸模型針對14種新條件進行了驗證，并預測了8周后霉菌的生長狀況，準確度超過96%。產品開發人員可以使用該模型來預測即飲飲料中的霉菌生長狀況。

Marín等[51]將概率模型首次應用于霉菌毒素的積累，在不同水分含量和貯存溫度條件下預測從開心果中分離出的A.carbonarius菌株的生長和OTA生產邊界。在評估水分含量對辣椒中黃曲霉生長的影響利用logistic回歸模型對黃曲霉生長邊界進行預測，結果表明，將辣椒或者辣椒粉的水分含量保持在30%以下，黃曲霉生長概率低于50%，辣椒含水量低于1%時，黃曲霉不生長。

Lindblad等[52]在溫度10～25 ℃，水分活度0.77～0.95 條件下對谷物接種疣孢青霉孢子展開谷物貯藏實驗。通過檢測青霉菌代謝產物OTA的水平是否超過法定限制5 mg/kg同時根據檢測值將疣孢青霉生長觀察值定值0或1。即0代表不生長，1代表生長。在不同的溫度和水分活度條件下，谷物疣孢青霉菌落達到一定數量時，利用Logistic 回歸模型計算超過法定限度的概率，通過模型有效地將谷物霉菌生長與產毒結合起來。

5 問題及應用展望

5.1 存在的問題

糧油食品供應鏈鏈條長環節多，危害物種類多，產生機理復雜。霉菌毒素可以在田間以及倉庫貯藏期間產生，并且不同的氣象條件、種植環境以及農藝技術等都會影響霉菌的生長及其次級代謝產物的產生。由于其危害物產生機理的復雜性，源頭控制危害物難度較大，因此宜采用預測模型的方式對關鍵環節如貯藏階段、加工環節等進行優化。

而目前對于預測模型研究存在的主要問題是模型數據源不完整，覆蓋不全面。以小麥真菌毒素模型構建為例，模型的構建不可能針對于所有的小麥品種，只能針對于特定區域小麥品種進行分析。同時預測模型的可信度和精準度也存在風險。現今大多數微生物模型的擬合都集中在實驗室基礎上進行仿真模擬，針對相應食品基質或者對應基質培養基來進行，但是經研究發現兩者擬合出的數據存在較大差別，后者擬合模型普遍存在可信度低的問題。且實驗室基礎的模型擬合只能是在有限的條件下，基于所獲得的有限數據基礎上的擬合，數據的不足是制約模型擬合精準度的最大難題。目前只能通過盡可能多的獲取數據來進行模型構建，但大量數據的獲取和數據庫的構建本身就是難度很大的挑戰。

5.2 展望

目前糧油食品中危害物的預測模型還主要是集中在對危害霉菌的生長預測模型研究，霉菌產毒素積累預測模型、產毒概率模型研究還比較少。今后應重點關注毒素預測模型，通過毒素含量及特定條件下的產毒概率直觀地反映食品的安全狀況。現階段對糧油食品加工過程中真菌毒素消減規律及加工階段毒素模型研究還較少。未來需要對加工階段的某些關鍵點進行大量模型參數擬合研究，以通過模型對加工階段的關鍵參數進行控制改進，嘗試進行加工環節的預警溯源分析。同時模型本身的構建基于大量實驗數據的獲取，這在實驗室研究基礎上是比較棘手的問題。因此只有通過在糧食食品供應鏈各環節中大量獲取真實有效的數據才能建立起較完整的糧油產業供應鏈微生物預測模型，這對建立適合我國國情的微生物預報體系具有極其重要的意義。