河鲀毒素及其檢測技術研究進展

王興龍，蔡 強，桂文鋒，倪曉鋒，蔡增軒，許嬌嬌，任一平

( 1.浙江清華長三角研究院分析測試中心，浙江 嘉興 314000； 2.上海師范大學 環境與地理科學學院，上海 200233； 3.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310051 )

河鲀毒素(TTX)固體純品為無色結晶體，粗制品呈棕黃色，無臭無味，易吸潮，微溶于水，易溶于微酸水溶液和醇溶液，不溶于乙醚、苯等非極性有機溶劑。河鲀毒素理化性質非常穩定，一般的烹飪溫度很難降低其毒性。目前，已分離鑒定出40余種天然河鲀毒素類似物，廣泛分布于海洋和陸地的多種生物體內，其積累傳遞和轉移的具體機制尚存爭議[1]，大多數學者認為是受食物及體內微生物共同影響的結果。河鲀毒素是一類毒性很強的生物堿，在自然界中僅次于由細菌產生的蛋白質毒素，毒性是氰化鈉的1250倍，可高選擇性和高親和性地阻斷神經興奮膜上鈉離子通道，從而抑制神經和肌肉間的興奮傳導，使得神經和肌肉產生麻痹，導致神經肌肉麻痹，甚至死亡[2]，這一特性可使河鲀毒素成為強效麻醉劑和戒毒良藥。生活中，時常有因食用河鲀、織紋螺等引發中毒事件的發生，且無特效藥物可以治療。據不完全統計，我國因食用河鲀而中毒死亡的人數每年高達100 人以上，死亡率高于60%，中毒原因的快速診斷，可為患者贏得搶救時間。近年來對河鲀毒素的綜述主要集中在前處理方法與檢測技術方面，筆者重點對河鲀毒素的化學結構、臨床癥狀、起源和當今檢測技術存在的問題進行綜述，為更好地預防控制河鲀毒素中毒提供基礎資料。

1 河鲀毒素的分布與結構

研究發現，河鲀毒素及其類似物，除分布在河鲀體內，還廣泛分布于海洋和陸地的多種生物體內，包括細菌[3-4][芽孢桿菌屬(Bacillus)、弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等]，有毒渦鞭毛藻(Toxicdinoflagellate)[5]，紐蟲(Cephalothrixsp.)[6]，白額縱溝紐蟲(Lineusalborostratus)[6]，扁形蟲(Planoceridflatworm)[7]，腹足類軟體動物如織紋螺(Nassariussp.)[8]、橡子織紋螺(N.glans)、硰羅法螺(Charoniasauliae)[9]，云斑裸頰蝦虎魚(Yongeichthyscriniger)[10]，花紋愛潔蟹(Atergatisfloridus)[11]，東方蠑螈(Cynopsorientalis)[12]，加州蠑螈(Tarichagranulosa)，藍紋章魚(Hapalochlaenafasciata)[13]，圓尾鱟(Carcinoscorpiusrotundicauda)[14]，帚狀槭海星(Astropectenscoparius)、濾沙海星(A.polyacanthus)[15]，仿刺參(Apostichopusjaponicus)，蟾蜍(Atelopuschiriquiensis)[12,16-17]，短頭蟾(Brachycephalusephippium)[18]等。1909年，日本學者Yoshizumi Tahara首次自河鲀卵巢中發現此毒素，因此以河鲀毒素命名。1955年，日本學者Hirata Yoshimasa成功自河鲀中分離到單體結晶的河鲀毒素[19]。1964年，Hirata Yoshimasa、Tsuda Kyosuke與Woodward同時利用X-衍射試驗，報道出河鲀毒素的結構[19]。河鲀毒素是一種雜環化合物，結構上的1個胍氨基和6個羥基為其活性基團，能以兩性離子形式存在，故在強酸強堿環境中不穩定[19]。胍氨基在生理條件下通過質子化形成正電活性區域, 與專一受體蛋白的負性羥基結合[19]，其周圍羥基以氫鍵形式與膜外層離子孔附近的受體結合。研究發現，河鲀毒素的胍基對阻斷鈉離子通道起決定性作用。截至目前，已分離鑒定出40余種天然河鲀毒素類似物，其結構式見表1。河鲀毒素的毒性與其化學結構息息相關，脫氧結構的化合物毒性較小，含羥基多的化合物毒性較大[20]。研究河鲀毒素各化合物的毒性，對全面評估河鲀毒素對人體健康的影響有著非常重要的意義。目前可獲得TTX與4,9 anhTTX兩種商業化的標準品，其他化合物標準品很難獲得，不能滿足日常的定量分析研究。

表1 河鲀毒素及其類似物的化學結構

(續表1)

2 河鲀毒素中毒的臨床癥狀及解救方法

一位50 kg成年人，河鲀毒素對其最小致死劑量約2 mg[28]。依據中毒者的身體狀況，年齡以及攝入河鲀毒素量的多少，患者會表現出不同的中毒癥，大致分為4個階段(表2)。通常，人們攝入含河鲀毒素食物30 min后，即可表現出中毒癥狀。當然，中毒者身體狀況不同，攝入河鲀毒素量不同，反應時間也會有很大差異。

2007年，歐洲發生一起白法螺(C.lampas)中毒事件，患者為49歲男性。數分鐘內出現腹痛、惡心、虛弱、口齒不清、呼吸困難等癥狀，3 d后癥狀痊愈，最終確定為河鲀毒素中毒[32]。2008年，孟加拉國多地暴發河鲀中毒事件，主要分布于Narshingdi、Natore、Dhaka District，本次中毒事件中95人食用了河鲀，其中49人僅表現出明顯中毒癥狀，14人死亡。63名患者平均年齡25歲，32名為男性，31名為女性。河鲀毒素中毒屬于急性中毒，在3 h以內，81%的人出現中毒癥狀。在死亡患者中，發生在3 h以內的占85.7%。據患者描述，91%出現身體刺痛感，68%出現口周麻木，64%出現頭暈，60%表現四肢無力，46% 表現惡心嘔吐。2010年10月，中國臺北發生一起食用藍紋章魚中毒事件，涉及人員為男性，年齡分別為39歲、42歲。較年輕患者，15 min內出現口角、手指、腳趾等麻木，稍后出現頭暈、嘔吐、心率失常等癥狀。年長者癥狀較為嚴重，呼吸困難，被送入重癥加強護理病房治療。兩名患者5 d內痊愈[13]。2014年6月，美國的明尼阿波利斯市發生一起使用河鲀魚干中毒事件，其中兩名患者被送入急診室[31]。樣本中河鲀毒素含量平均值為19.8 mg/kg，食用30 min后出現口周、舌頭麻木癥狀，6 h 癥狀得到緩解。

當前，河鲀毒素中毒并無特效藥物可以治療，在就診早期，對中毒者洗胃和催吐是重要的措施，在食入2～4 h進行者療效較佳，洗胃完成之后可采用25%甘露醇或硫酸鎂進行導瀉操作[33]。其他輔助治療辦法，主要包括機械輔助通氣、心理護理等輔助療法與緩解麻痹癥狀的化學藥物療法，其中涉及到藥物主要有納洛酮、新斯的明、阿托品、多巴胺等。2005—2008年，以色列有13人呈現出河鲀毒素中毒癥狀[30]，其中2人最為嚴重，10 min 內均出現中毒癥狀，他們需要機械控制通氣12～24 h，其中1人靜脈注射了 0.4 mg 納洛酮。所有中毒者，住院時間為1～4 d。為防止呼吸衰竭的發生，即使中毒癥狀較輕者，最好留院觀察1 d以上。2008年，孟加拉國多地暴發河鲀中毒事件，諾多爾的8名中毒患者，表現出肌肉麻痹癥狀，先后注射新斯的明(50 μg/kg)，阿托品(15 μg/kg)[34]，其中2名患者3.5 h后死亡。吉紹爾甘杰縣、諾爾辛迪縣的7名患者，也接受了新斯的明、阿托品的治療，其中3人最終死亡。2010年10月，中國臺北章魚中毒事件中，一名病情嚴重者通過機械控制通氣，注射一定量的多巴胺，5 d內痊愈[13]。綜上所述，對河鲀毒素中毒患者采取積極的搶救和全面的護理，有利于提高患者搶救成功率，保障患者生命安全。

3 河鲀毒素醫學價值

河鲀毒素是一種非常有效的非蛋白特異性阻滯劑，可阻斷鈉離子通道，從而抑制神經和肌肉間的興奮傳導，使得神經和肌肉產生麻痹，這一特性可使河鲀毒素成為鎮痛與麻醉藥物，與商業化的麻醉藥物合用，可增強麻醉效果[35]。很多研究證明，河鲀毒素可治療痛覺過敏、機械性疼痛、戒斷綜合征等，還可預防痛覺過敏、異常性疼痛。Hagen等[36-37]對參與臨床試驗的癌癥患者，分別皮下注射30 μg 河鲀毒素及等劑量的對照物，2次/d，連續4 d，發現河鲀毒素可有效緩解癌癥引發的疼痛，該項臨床試驗已在美國牙科與顱面研究所注冊。河鲀毒素可預防痛覺過敏、異常性疼痛。Hong等[38]建立帶狀皰疹后神經痛大鼠模型，將一定量的河鲀毒素灌喂大鼠體內，發現此種給藥方式可預防機械性異常性疼痛與痛覺過敏。Alvarez等[39]建立了大鼠持續性肌肉疼痛模型，發現河鲀毒素可治療炎癥引發的肌肉疼痛以及化療引起的神經痛。Gonzalez-Cano等[40]研究發現，河鲀毒素還可治療內臟痛。河鲀毒素除去具有鎮痛與麻醉作用外，還可用于解除毒癮。臨床結果顯示，給予毒癮人員河鲀毒素5～10 μg，3次/d，明顯緩解“戒毒綜合征”，且不會引起不良反應[41-42]。陳永強[43]采用大鼠烏頭堿心律失常模型，研究了河鲀毒素利多卡因復方制劑的抗心律失常療效，結果表明，河鲀毒素和利多卡因具有較好的抗心律失常協同作用。河鲀毒素雖然具有上述潛在的臨床價值，但是我國對河鲀毒素的綜合利用尚處于初級階段，需要更加深入的研究，提高河鲀毒素的利用價值。

表2 河鲀毒素中毒表現出的臨床癥狀[29-30]

4 河鲀毒素的起源

長期以來，國內外學者對河鲀毒素的起源進行了一系列研究，目前主要形成“內源說”和“外源說”兩種學說。

4.1 內源說

主張內源說的學者認為，生物體內的河鲀毒素不是由外界攝入，而是由其自身產生。Tsuruda等[44]對蠑螈體內河鲀毒素的研究發現，當蠑螈受到外界刺激后，其皮膚表面的腺體會分泌河鲀毒素(主要為TTX與6-epiTTX)，積聚于肌肉組織與表皮內，表皮毒素含量明顯高于肝臟。Magarlamov等[6]首次利用共聚焦掃描顯微鏡與電子免疫技術對河鲀毒素在紐蟲體內的分布進行研究，發現河鲀毒素可通過蛋白分泌物進入顆粒腺體，提出了河鲀毒素在細胞內的遷移和排泄途徑的假設。Matsumura[45]利用星點東方鲀(Takifuguniphobles)的魚卵進行人工授精并培育，發現隨著孵化時間的延長，胚胎內的毒素含量在逐漸增加，表明河鲀毒素是胚胎發育過程中的產物。

由此可知，河鲀毒素可能并非直接來源于外界環境，但是河鲀等生物能否完全靠自身產生毒素及其在各器官間的傳遞機制，還需進一步深入研究。

4.2 外源說

多數專家學者認為，河鲀毒素的真正來源不是動物本身, 而是通過食物鏈聚集或與其共生的微生物。Itoi等[46]研究發現，河鲀幼魚體內的毒素遺傳于成年河鲀，野外生存環境中的河鲀幼魚體內含有河鲀毒素，而飼養的河鲀幼魚體內卻沒有，這說明成年河鲀體內的毒素很可能來源于外界環境。河鲀幼魚也可通過攝入含有河鲀毒素的扁形蟲，將河鲀毒素蓄積體內，防止被其他捕食者捕食[47]。Turner等[48]追蹤河鲀毒素起源，在英格蘭地區發現了兩個含有高濃度河鲀毒素的紐蟲新物種，并在其體內發現可產河鲀毒素的假單胞菌、溶藻弧菌(V.alginolyticus)，這些菌種與之前諸多學者的發現相同。Campbell等[4]也從紋腹叉鼻鲀(Arothronhispidus)的外皮黏液、內臟器官中分離到產河鲀毒素的哈維氏弧菌(V.harveyi)。

河鲀毒素不僅分布于河鲀體內，還廣泛分布于甲藻類、蠕蟲類、腹足類、甲殼類、軟體類、兩棲類等生物體內。研究發現，這些生物體內均含多種能產生河鲀毒素及其類似物的細菌。但是，通過體外培養分離純化的菌株，又很難得到大量毒素，這有可能是培養環境中缺乏從宿主體內獲得的誘導物。綜合來看，這些產毒菌可能是通過食物鏈進入生物體內，并與其建立共生關系。

5 河鲀毒素檢測技術

根據不同方法的檢測原理，可將目前常見的河鲀毒素檢測方法歸納為生物法、免疫法和理化檢測分析法3大類。

5.1 生物法

小鼠生物法[49]是目前中國與日本等國的法定河鲀毒素檢測方法，根據小鼠注射試樣提取液后的死亡時間，查出鼠單位，并按小鼠體質量校正鼠單位，計算確定河鲀毒素含量。其毒力單位使用MU表示，采用20.0 g的無特定病原體級昆明系雄性小鼠，以30 min 死亡的劑量規定為1 個鼠單位(MU)，相當于0.18 μg 河鲀毒素。河鲀毒素同系物較多，與麻痹類貝類毒素中毒癥狀相似，這種方法也不能區別出具體化合物。

5.2 免疫法

酶聯免疫分析技術是利用抗原、抗體的高度特異性結合反應和抗體、抗原上的標記物(酶、熒光物質、磁珠、膠體金等) 的生物、物理、化學信號放大作用來實現的，是食品安全領域應用最多的快速檢測技術。免疫法具有高度的特異性，因此不適宜同時檢測河鲀毒素的某些毒性衍生物。針對河鲀毒素檢測，最常用的免疫檢測技術有酶聯免疫吸附法、免疫磁珠層析吸附法、膠體金標記免疫層析法、熒光標記免疫層析法、電化學免疫分析法等。

Ling等[50]利用河鲀毒素與牛血清白蛋白的偶聯物作為免疫抗原，結合單克隆抗體的專一性，設計出酶聯免疫吸附試驗，檢出限可達4.44 μg/kg。同時設計出膠體金標記的免疫檢測試紙條，檢測限可達20 μg/kg，檢測時間小于10 min。張世偉等[51]利用熒光微球作為標記物，避免了基質和熒光素的近距離接觸，而使熒光信號的淬滅，設計出河鲀毒素檢測的高靈敏度的熒光微球免疫層析法，檢測限可達10 μg/kg。Ling等[52]將特異性單克隆抗體偶聯到40 nm的膠體金上，將羊抗鼠二抗噴涂至醋酸纖維膜上作為控制線，建立膠體金免疫層析法快速測定水產品中的大田軟海綿酸與河鲀毒素，河鲀毒素的檢測限可達15 ng/mL，且兩者無交叉反應。梁田田等[53]利用磁珠作為標記物，開發出免疫磁珠層析試紙條，可實現河鲀毒素的快速檢測。

5.3 河鲀毒素理化分析技術

目前，河鲀毒素檢測常用的理化檢測方法主要有氣相色譜—串聯質譜法(GC/MS)[49,54-55]、核磁共振(NMR)[21,56]、紅外光譜(IR)[57]、液相色譜—熒光檢測法(LC-FLD)[57-58]、液相色譜—串聯質譜法(LC-MS/MS)[5,58-60]等。這些方法不僅可以實現河鲀毒素的定性定量分析，還可對其他同系物進行分析，使得河鲀毒素的檢測結果更加可靠。

河鲀毒素不具揮發性，利用氣相色譜—串聯質譜法檢測之前，需將河鲀毒素轉化為易揮發的衍生物，這不僅增加了檢測的時間，還加大了檢測結果的不確定性。核磁共振、紅外光譜對前處理過程要求較嚴，主要用于標準物質的純度分析。液相色譜—熒光檢測法對于河鲀毒素的檢測應用相對廣泛，但是河鲀毒素種類繁多，對熒光的響應相差較大，這在一定程度上限制了該方法的應用[20]。相對于上述方法，液相色譜—串聯質譜法對河鲀毒素的檢測存在較大的優勢，無需衍生化處理，同時可分析多種河鲀毒素，該方法的前處理技術、色質譜條件見表3。

由表3可見，提取液主要為0.1%～1.0%乙酸或甲醇。弱酸環境，可維持河鲀毒素結構的穩定性。以C18與超濾離心柱為凈化方法，相對簡單，節約成本，但凈化效果相比于免疫親和柱較差，比沸水浴、冷凍離心的效果好。由于河鲀毒素親水性較強，所以選擇的色譜柱為HILIC或Amide柱。流動相中加入適量甲酸，可提高檢測靈敏度。

5.4 河鲀毒素檢測方法的比較

河鲀毒素的各種檢測方法均有利弊(表4)。小鼠生物法雖是國際公認方法，伴隨動物保護主義的興起，其應該會被其他方法所取代。免疫技術被廣泛應用于樣本初篩，如何快速、簡單、高效地完成現場檢測，是其未來發展的方向。相比于ELISA方法，免疫層析技術更具有優勢，無需特殊設備，數十分鐘即可出結果，在河鲀毒素的快速檢測領域具有較好的發展空間。理化檢驗法，對設備、人員要求更高，在定量檢測方面具有無法取代的地位。

表3 液相色譜—質譜法對河鲀毒素及其類似物的檢測

(續表3)

表4 河鲀毒素檢測方法的比較

(續表4)

6 結 語

河鲀毒素是一種麻痹神經的劇毒物質，目前分離鑒定出40余種天然河鲀毒素，廣泛分布于兩棲、海洋生物中，是食用海產品中毒事件的一類重要致毒因子，建議相關政府部門加大監管力度，繼續禁止織紋螺、野生河鲀等在市場上流通，盡量避免因河鲀毒素而導致食物中毒的發生。目前，大多數商業化的河鲀毒素標準品很難獲得，這影響了其在醫療和公共衛生等領域的進一步開發和應用。當前，河鲀毒素在臨床上的研究極為普遍，但對于河鲀毒素的臨床應用仍停留在初級階段，河鲀毒素獨特的生理作用，如鎮痛、麻醉、戒毒以及抗心律等特殊功效還需進一步研究。河鲀毒素中毒事件中，主要使肢體麻痹，臨床癥狀明顯，醫生可根據臨床癥狀，對病因做出正確的判斷。河鲀毒素中毒雖沒有特效藥物可以治療，但一些輔助措施，可緩解癥狀，未來特效藥物的研制具有重大意義。河鲀毒素在自然界傳遞，可能是產毒菌通過食物鏈進入生物體內，并與其建立共生關系，或者通過食物鏈直接蓄積于生物體內。在各類檢測方法中，免疫層析技術更適用于河鲀毒素的快速檢測，液相色譜串聯質譜法適用于河鲀毒素多種同系物的同步定量檢測。