24-表油菜素內酯調控活性氧代謝增強杏果實采后抗病性

石 玲，李麗花，張瑞杰，李亞玲，李 玲，張 昱，廖海慧，朱 璇*

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）屬薔薇科李屬。據2018年數據統計，新疆杏樹種植面積約為12萬 hm2，產量達115萬 t，占全疆水果總種植面積的12.12%、總產量的11.37%[1]。杏在采后貯運過程中易遭受到病原微生物的侵染而發生腐爛，造成嚴重的采后損失，其中由鏈格孢菌（Aletrnaria aletrnata）引起的杏黑斑病是杏果實主要的采后病害[2]。目前，主要采用化學殺菌劑控制杏果實黑斑病的發生，但由于其安全性和殘留危害等問題而受到限制[3]。

油菜素內酯是一種重要的植物甾醇類激素，已被公認為是第6類植物激素，在植物體內含量極低，但生理活性極高。有研究表明，油菜素內酯在抵抗各種異常的溫度、干旱、高滲透壓及病原菌侵襲的過程中發揮了十分重要的作用[4]。Noreen[5]研究發現油菜素內酯可調控棉花對黃萎病菌抗性，增強甜瓜葉片等植物的耐熱性[6-7]。在采后果蔬的研究中發現，外源油菜素內酯處理可以提高茄子[8]和草莓[9]果實的抗氧化性，減輕桃[10]、杏[11]和香蕉[12]果實貯藏期間冷害的發生。張正敏等[13]研究發現24-表油菜素內酯（24-epibrassinolide，EBR）處理抑制桃果實采后軟腐病的發生與其維持較高的能荷水平有關。李麗花等[14]研究表明EBR有可能通過誘導杏果實苯丙烷代謝增強來提高果實對A. alternata的抗病性。

活性氧代謝在果蔬成熟、衰老及采后抗病性等方面發揮著重要作用。病原侵入后，寄主最快的抗病反應就是產生大量的活性氧，主要包括超氧陰離子自由基（O2-·）、H2O2等[15-16]。近年來的研究推測活性氧可能作為一種植物胞內信號分子激發相關抗性酶活性的增加，參與植物的抗性活動[17-18]。研究表明，水楊酸、茉莉酸甲酯、苯并噻二唑等處理誘導采后芒果[19]、枇杷[20]、桃[21]果實抗病性增強，均與其對活性氧的調控密切相關。研究發現，采后香蕉果實經熱處理誘導產生耐冷性也與果皮活性氧的迅速積累和引起的防御反應有密切關系[22]。

果蔬抗病性的效果因生物調節劑的種類、濃度、果蔬種類、誘導時間及誘導處理方法的不同而不同。目前EBR處理誘導抗病性的研究多數集中在作物對真菌和細菌的抗性，然而關于EBR處理對杏果實采后病害控制的抗病性與活性氧代謝關系還鮮見報道。針對上述問題，本研究以杏果實為實驗材料，結合透射電子顯微鏡觀察杏果實超微結構，主要探究EBR（目前市售活性最強的一種）處理對杏果實采后活性氧代謝、抗病性及超微結構的影響，以期完善油菜素內酯處理增強果實采后抗病性的理論，并為該處理應用實踐提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘賽買提’杏果實于2018年6月23日采自新疆庫車縣烏恰鎮杏果園，剔除有機械損傷和病蟲害的杏果實，選取成熟度（可溶性固形物質量分數12%～13%、硬度（18.0±0.5）N）、大小相近的杏果實，套發泡網裝箱后，當天運回，于通風陰涼處除去田間熱。

用于杏果實損傷接種的病原菌A. alternata，由新疆農業大學微生物實驗室提供。

所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AL204-IC電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;UV-1700紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司;FW-80高速萬能粉碎機 廣州儀科實驗室技術有限公司;SHB-III循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司;3H16RI智能高速冷凍離心機湖南赫西儀器裝備有限公司;DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫療儀器廠;JEOLTEM-1230型電子顯微鏡日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理與分組

參照本課題組前期的研究[14]，選擇0.9 mg/L作為EBR處理質量濃度。溶液配制方法：用2.0 mL無水乙醇溶解1.80 mg EBR，然后用蒸餾水定容至2 L，即配制好的0.9 mg/L EBR溶液含體積分數0.1%乙醇。

實驗分為實驗組和處理組，對浸泡在EBR溶液中的杏果實進行抽氣減壓處理，在0.05 MPa下保持2 min后于常壓下浸泡5 min（處理組），以含體積分數0.1%乙醇的蒸餾水進行抽氣減壓處理的杏果實作為對照組。每組設3 個平行，每個平行3 kg杏果實。自然晾干后置于溫度（1.0±0.5）℃、相對濕度90%～95%的冷庫中貯藏48 h后進行損傷接種處理。

1.3.2 損傷接種

參照Deng Lili等[23]的方法并稍作修改。取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）培養7 d的A. alternata，加入含有0.05% Tween-80的無菌水20 mL，用無菌藥匙刮下PDA上的孢子，轉移到50 mL三角瓶內，搖勻后用紗布濾除大塊絮狀物，將A. alternata孢子濃度調節至1×106個/mL。先用無菌水擦拭杏果實的表皮并晾干，再用體積分數75%的乙醇溶液擦洗消毒。晾干后用滅菌的鐵釘在杏果實縱向中心線兩側等間距穿刺2 個直徑2 mm、深5 mm的孔洞，每個孔洞分別注入15 μL孢子懸浮液，損傷接種后，將果實放入筐中套好保鮮袋于溫度（1.0±0.5）℃、相對濕度90%～95%的冷庫中貯藏。定期取樣觀察測定相關指標。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 發病率及病斑直徑的測定

定期記錄貯藏期間各組出現病害的杏果實發病孔數（病斑直徑大于3 mm記為發病孔數），發病率按下式計算。

將接種部位果皮削去，用直尺在病斑處進行十字交叉法測量病斑直徑/mm。

1.3.3.2 H2O2含量、過氧化氫酶活力的測定

H2O2含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定參照曹建康等[24]的方法。H2O2含量單位為μmol/g，結果以鮮質量計;以每克鮮杏組織在240 nm波長處每分鐘吸光度變化0.01表示1 個CAT活力（U）。

1.3.3.3 O2-·產生速率和超氧化物歧化酶、過氧化物酶活力的測定

O2-·產生速率的測定參照曹建康等[24]的方法，以每分鐘每克鮮質量杏組織產生O2-·物質的量為O2-·產生速率，單位為nmol/（min·g）。

超氧化物歧化酶活力（superoxidedismutase，SOD）活力的測定參照曹建康等[24]的方法，以每克杏果實每分鐘在240 nm波長處吸光度增加0.01為1 個SOD活力單位（U）。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力參照朱廣廉等[25]的方法，以每克鮮質量杏組織在470 nm波長處吸光度每分鐘增加1為1 個POD活力單位（U）。

1.3.3.4 丙二醛含量、細胞膜滲透率的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、細胞膜滲透率的測定參照曹建康等[24]的方法，丙二醛含量單位為nmol/g。

1.3.3.5 超微結構的測定

由于杏果實貯藏期間的前期和中期以及末期對比差異比較明顯，因此在杏果實采收當天和貯藏的第28、42天分別取樣。用雙面刀片取杏果實病-健交界處果肉切成1 mm×1 mm×2 mm的塊狀，每次取樣的部位保持一致。

樣品用體積分數2.5%戊二醛溶液固定14 h后，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液浸泡清洗樣品，浸泡時間為10 min，浸泡清洗3 次。然后用體積分數1%～2%鋨酸固定1 h，以確保組織浸入鋨酸中。鋨酸固定后，用蒸餾水清洗3 次，每次10 min，之后用醋酸鈾染色1.5 h。再用體積分數50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液依次進行梯度脫水，之后用純丙酮置換20 min。置換后用包埋劑浸潤組織之后進行聚合，最后使用LeicaUC切片機切成60 nm的薄片，再用JEOLTEM-1230型電子顯微鏡拍照。

1.4 數據處理與分析

使用SigmaPlot 12.0軟件整理數據并制圖，利用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析，采用Duncan’s進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 EBR處理對杏果實接種A. alternata病斑直徑及接種發病率的影響

圖 1 EBR處理對杏果實接種后發病率（A）及病斑直徑（B）的影響Fig. 1 Effect of EBR treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) in inoculated apricot fruit

如圖1所示，在接種后的貯藏期間，杏果實接種發病率呈現不斷增長的趨勢，但對照組杏果實接種發病率一直高于EBR處理組。第35天，EBR處理組杏果實接種發病率是對照組杏果實接種發病率的53.25%（P＜0.05）;同時，EBR處理組杏果實病斑直徑一直低于對照組，貯藏第28天，對照組和EBR處理組杏果實病斑直徑分別為8.50 mm和5.10 mm，對照組杏果實病斑直徑比EBR處理組高66.67%（P＜0.05）。

2.2 EBR處理對杏果實H2O2含量及CAT活力的影響

圖 2 EBR處理對杏果實H2O2含量（A）、CAT活力（B）的影響Fig. 2 Effect of EBR treatment on H2O2 content (A) and CAT activity (B) in apricot fruit

如圖2A所示，杏果實損傷接種A. alternata后，H2O2迅速積累。在貯藏第14天，對照組杏果實H2O2含量達到累積高峰值，為3.00 μmol/g，EBR處理組杏果實在貯藏第21天時，H2O2含量達到累積高峰值（3.52 μmol/g），高于同期對照組30.17%（P＜0.05），較對照組推遲7 d達到H2O2含量的累積高峰，同時在貯藏21 d后，EBR處理組杏果實H2O2含量緩慢下降，最終低于對照組。

如圖2B所示，杏果實接種A. alternata后，在貯藏前期EBR處理組杏果實CAT活力低于對照組杏果實。在貯藏14～21 d，EBR處理組杏果實CAT活力提高24.57%。在貯藏21 d后，EBR處理組杏果實中CAT活力顯著高于對照組杏果實。在貯藏42 d時EBR處理組杏果實CAT活力為2.05 U，是對照組杏果實的1.27 倍（P＜0.05）。

2.3 EBR處理對杏果實O2-·產生速率的影響

圖 3 EBR處理對杏果實O-2·產生速率的影響Fig. 3 Effects of EBR treatment on O2-· production rate of apricot fruit

由圖3可知，杏果實O2-·產生速率在接種后的貯藏過程中迅速上升，并且第21天達到最大值，此時對照組杏果實O2-·產生速率為669.33 nmol/（min·g），EBR處理后的杏果實O2-·產生速率低于對照組杏果實23.46%。在貯藏到第42天，對照組杏果實O2-·產生速率比EBR處理組高20.80%（P＜0.05）。

2.4 EBR處理對杏果實SOD、POD活力的影響

圖 4 EBR處理對杏果實SOD（A）、POD（B）活力的影響Fig. 4 Effect of EBR treatment on SOD (A) and POD (B) activity of apricot fruit

如圖4A所示，杏果實損傷接種A. alternata后，在貯藏期間SOD活力呈現先上升后下降的趨勢，且EBR處理組杏果實SOD活力顯著高于對照組杏果實。在貯藏第14天，對照組和EBR處理組杏果實SOD都達到活力高峰，分別為1.217 3 U和1.278 1 U。說明EBR處理能夠有效提高杏果實采后貯藏過程中SOD活力。

如圖4B所示，隨著貯藏時間的延長，杏果實POD活力呈現逐漸上升的趨勢。在整個貯藏過程中，EBR處理組杏果實POD活力一直高于對照組杏果實。在貯藏的第7天，EBR處理組杏果實POD活力比對照組杏果實高28.99%。在貯藏的第42天，EBR處理組杏果實POD活力為5.02 U，比對照組高15.67%（P＜0.05）。

2.5 EBR處理對杏果實MDA含量和細胞膜滲透率的影響

如圖5A所示，杏果實MDA含量隨貯藏時間的延長呈現逐漸上升的趨勢，EBR處理組的杏果實MDA含量始終顯著低于同期對照組，且在21 d后差異顯著（P＜0.05）。在貯藏第35天時，對照組杏果實MDA含量為0.92 nmol/g，比同期EBR處理組高37.31%（P＜0.05）。表明EBR處理可有效抑制杏果實采后損傷接種A. alternata后的MDA含量上升。

由圖5B可知，杏果實細胞膜滲透率隨著貯藏時間延長呈逐漸上升趨勢，EBR處理組杏果實細胞膜滲透率始終低于對照組，且在14 d以后差異顯著（P＜0.05）。貯藏第35天，對照組杏果實細胞膜滲透率為63.70%，比EBR處理組高35.56%（P＜0.05）。說明EBR處理可有效抑制杏果實采后損傷接種A. alternata后的細胞膜滲透率上升。

圖 5 EBR處理對杏果實MDA含量（A）和細胞膜滲透率（B）的影響Fig. 5 Effects of EBR treatment on MDA content (A) and cell membrane permeability (B) in apricot fruit

2.6 EBR處理對杏果實對細胞超微結構的影響

圖 6 杏果實采收當天細胞超微結構Fig. 6 Cell ultrastructure of apricot fruit on the day of harvest

從圖6A可以看出，杏果實在采收當天細胞整體結構清晰且完整，各細胞器結構無損，細胞器間膜結構清晰可見;液泡的體積占整個細胞的80%以上，液泡與各細胞器之間的膜清晰且完整。圖6B、C顯示出葉綠體雙層膜結構完整，嗜鋨顆粒在葉綠體中分布均勻且清晰，具有完整的內部結構;細胞核及內質網膜結構明顯。由圖6D可知，細胞壁結構完整，無細胞間隙，與細胞質緊貼;細胞質形態正常，含有大量細胞器，如線粒體和葉綠體。

杏果實貯藏第28天細胞超微結構發生了明顯改變（圖7）。如圖7A所示，貯藏28 d后，EBR處理組的杏果實細胞結構較對照組明顯完整，胞內囊泡膨脹增大;葉綠體雙層膜結構模糊，葉綠體形狀開始改變，并且基粒片層和基質片層結構模糊，嗜鋨顆粒增大;液泡結構發生改變，液泡膜邊緣模糊;線粒體較完整，數量較多。由圖7B可知，貯藏28 d后，對照組杏果實液泡形狀變化明顯，液泡膜降解，形成絮狀孔洞;細胞質呈絮狀，細胞開始出現扭曲，各細胞器膜皺縮，細胞器數量明顯減少，細胞囊泡化嚴重;線粒體數量明顯減少，出現孔洞化，且膜結構模糊;葉綠體膜結構破壞，無明顯形態。

圖 7 杏果實貯藏第28天細胞超微結構Fig. 7 Cell ultrastructure of apricot fruit after 28 days of storage

由圖8A可知，杏果實貯藏42 d后，EBR處理的杏果實也出現細胞器細胞壁變形，細胞壁也出現質壁分離的現象，細胞器膜及液泡膜均發生降解。由圖8A4可知，杏果實細胞內各細胞器無規則排列，細胞質呈現絮狀沉淀，細胞間隙明顯且增大，葉綠體和線粒體等細胞器雙層膜結構消失，但與對照組相比仍清晰可見。如圖8B1、B2所示，杏果實貯藏42 d后，對照組杏果實中各細胞器解體并與細胞質混合，且呈現出絮狀，細胞壁扭曲變形，質壁分離嚴重;液泡呈現無規則形態，液泡膜破損降解;葉綠體雙層膜結構消失，嗜鋨顆粒極少，呈明顯的空腔化;細胞內結構破壞嚴重，細胞器及細胞質渾濁（圖8B3）。細胞內含物大量減少，大量細胞器降解消失，出現明顯的質壁分離，囊泡和細胞間隙明顯增多（圖8B4）。

3 討 論

研究表明，果實體內活性氧代謝與果實抗病性密切相關，植物細胞在受到病原菌等脅迫時，能激發H2O2的產生，并以此來調控一系列應答脅迫的信號傳導，啟動寄主的防御反應，而且H2O2對病原菌增殖具有一定抑制作用[26]。本實驗中，在接種前期EBR處理能有效抑制杏果實CAT活力，促進H2O2積累，H2O2作為信號分子，激活杏果實SOD、POD等抗病相關酶活力，誘導果實增強抗病性。這與Xia Xiaojian[27]和楊藝琳[28]等的研究結果一致，以上研究均表明H2O2作為信號分子在EBR誘導抗性中發揮著重要作用，其前期持續的高含量提高了生物體抵抗病原菌入侵的應激防御能力。但自由基的過度累加會加劇膜脂過氧化，造成細胞膜脂系統的損傷[29]，本實驗中，杏果實EBR處理組SOD活力始終高于對照組，且在接種后期EBR處理組CAT活力明顯高于對照組，因此有效避免了H2O2和O2-·過度累積對果實產生的傷害。MDA含量可衡量細胞膜脂過氧化程度[30]，本實驗中EBR處理誘導杏果實酶促防御體系SOD、POD等抗氧化酶活力的增加，有效抑制膜脂過氧化作用，使處理組杏果實保持較低細胞膜滲透率和MDA含量，這也有助于增強杏果實的抗病性。EBR處理誘導葡萄葉片抵御霜霉病和葡萄果實抵抗灰霉病[31]、大白菜抗軟腐病[32]，殼聚糖誘導臍橙抵抗青霉病[33]的實驗結果也表明果蔬抗病性的增強與H2O2快速積累和抗病相關酶SOD、POD等活力增強有密切關系。

細胞是生物體最基本的結構和功能單位[34]，觀察果實細胞超微結構變化，對于研究果實采后生理[35]和抗病性[36]具有重要意義。本實驗對杏果實超微結構的觀察發現，EBR處理能有效地維持杏果實細胞壁和線粒體、葉綠體等結構的完整性和穩定性，對增強杏果實抗病性具有積極作用，榮瑞芬等[37]觀察發現UV-C照射采后番茄果皮能延緩葉綠體等細胞器解體，可提高番茄果實對A. alternata的抗性。EBR處理增強杏果實采后抗病性的原因可能是多方面的，其機理有待進一步研究。

4 結 論

0.9 mg/L的EBR處理可較好維持杏果實在貯藏期間細胞壁和線粒體、葉綠體等結構的完整性，延緩杏果實細胞膜滲透率和發病率的上升，顯著抑制病斑直徑和MDA含量的增加，增強了杏果實中SOD、POD和接種后期CAT等抗性相關酶活力，能有效提高杏果實前期H2O2含量的積累，減緩·的產生速率，較好地調控杏果實體內活性氧代謝，增強杏果實抗病性。