大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測系統的構建

于祝祝，林 洪，王靜雪*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

三文魚是世界上最重要的商品魚類之一，其中最具代表性的是大西洋鮭，由于其豐富的營養價值及鮮嫩的生食口感廣受消費者青睞。近年來，隨著生活水平的提高以及膳食結構的轉變，人們對大規格、高品質的冷鮮三文魚塊的需求逐年上升[1-2]，這就對其品質監測及保質期的延長提出了更高的要求。但是，切割后的魚體表面存在大量的微生物，會在貯藏過程中分解魚肉中的蛋白質等營養物質，導致魚肉的腐敗變質，影響產品品質及貨架期。Gram等認為食物腐敗可能是由化學反應和物理損害引起的，但是食物腐敗的主要原因是微生物生長和代謝導致形成胺、硫化物、醇、醛、酮和有機酸等，這些物質產生令人不愉快和不可接受的異味，微生物是大多數水產品腐敗的主要原因[3]。J??skel?inen等認為魚體死后的第一次變化（ATP、蛋白質分解）是由內源酶引起的[4]，但微生物活動仍是鮮魚腐敗的主要原因[5]。

GB 10136—2015《食品安全國家標準 動物性水產制品》[6]中規定，生食制的動物性水產制品的菌落總數最高限量為105CFU/g。現有的三文魚研究中，通常測得的三文魚初始微生物數量在102～104CFU/g之間[7-10]，隨貯藏時間的延長，菌落數量逐漸增多，在臨近腐敗時微生物數量達到107CFU/g左右。而在眾多微生物中，特定腐敗菌被認為是食品腐敗的主導者[11]。目前對于三文魚的研究結果表明，三文魚在大多數貯藏過程中的特定腐敗菌為假單胞菌，它與三文魚的腐敗情況有著極高的相關性[7,12-13]。與此同時，劉娜娜的研究表明，希瓦氏菌與水產品的三甲胺、揮發性鹽基氮等腐敗物質的產生有關[14]。因此，在三文魚生產、流通及貯藏過程中，對菌落總數、假單胞菌數量以及希瓦氏菌數量的監控尤其重要。

利用傳統方法進行微生物培養、計數往往需要2～3 d的時間，不利于流通環節中對三文魚的品質進行監測和預判。預測微生物學將微生物學、數學及計算機技術等相結合，用數學方法描述微生物數量與外界環境之間的響應關系，可以完成對微生物生長動力學的預測，從而能夠很好地對微生物生長進行監控、預測產品貨架期，極大降低食品腐敗風險[15]。張新林等將熒光假單胞菌接種于無菌三文魚塊和三文魚汁中，建立了不同溫度條件下三文魚中熒光假單胞菌的生長預測模型，發現修正的Gompertz方程擬合所得的各溫度下貨架期方程更優[16]，Powell等開發了用于預測冷藏溫度（0～10 ℃）氣調包裝貯存的大西洋鮭魚中細菌的生長預測模型[9]。丁婷等研究了不同冷藏溫度下三文魚片中菌落總數、明亮發光桿菌、乳酸菌、假單胞菌以及產H2S細菌的生長情況，發現Baranyi and Roberts模型能更好地描述冷藏三文魚片中微生物的生長，Belehradek方程能很好地預測三文魚片的剩余貨架期[17]。但是，目前已有研究大都停留在擬合獲得參數、建立模型公式的階段，用戶仍需學習基礎模型的使用并且通過計算僅能獲得時間點的信息，缺乏對未來生長趨勢的直觀認識。ComBase是目前已有的預測微生物學信息數據庫，可以在線預測不同生長條件下多種微生物的生長情況[18]，但所得數據大多基于培養基條件，與三文魚本身作為生長基質、多種微生物自然生長的狀態有所不同。因此，如何將三文魚貯藏過程中微生物的生長模型生成軟件、更好地應用模型指導生產仍是目前需要解決的問題。

本實驗通過測定不同貯藏溫度（4、10、25 ℃）下大西洋鮭魚片的菌落總數、假單胞菌和希瓦氏菌的數量，發現大西洋鮭魚肉上不同微生物的生長規律。通過一級模型建立恒溫貯藏過程中微生物數量與貯藏時間的關系，通過二級模型建立貯藏溫度與微生物生長延滯時間、最大比生長速率的關系，進而完成對0 ℃以上條件貯藏大西洋鮭中微生物生長過程的預測。在公式擬合的基礎上通過Visual Basic語言的編寫，將更多公式和計算過程由計算機后臺承擔，實現用戶僅需輸入初始微生物數量、溫度、貯藏時間，即可獲得當前微生物數量以及微生物生長曲線，達到簡化預測模型應用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大西洋鮭樣品購自東方海洋科技股份有限公司煙臺三文魚養殖場。

平板計數瓊脂培養基 北京陸橋技術股份有限公司;鐵瓊脂培養基、假單胞選擇性培養基、假單胞選擇性培養基添加劑 青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;HN-08拍擊式無菌均質機 上海漢諾儀器有限公司;HH-BH電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;Axz-260B光照培養箱 寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

活魚捕撈后在加工車間按照正常售前處理方式進行清洗、去皮、切塊、包裝，以層魚層冰的形式放入保溫箱中運往實驗室，在超凈工作臺中進行切塊，每塊約25 g，采用無菌均質袋包裝，放入恒溫培養箱中進行貯藏，溫度分別為4、10 ℃及25 ℃。貯藏過程中選擇適合的時間間隔取樣測定。

1.3.2 微生物數量測定

在特定的貯藏時間間隔取出裝有魚肉的均質袋放入超凈工作臺中，在裝有25 g魚肉的無菌均質袋中倒入225 mL無菌生理鹽水，采用無菌均質機拍擊3 min制成樣品勻液，菌落總數的測定方法參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[19]進行。假單胞菌數的測定采用假單胞選擇性培養基進行平板計數，梯度稀釋操作過程同菌落總數的測定，在培養基冷卻至50 ℃左右、未傾注平板前加入假單胞選擇性培養基添加劑，晃動錐形瓶使其混合均勻，然后傾注平板，待平板凝固后翻轉，（30±1）℃下培養（48±2）h。希瓦氏菌數量測定采用鐵瓊脂培養基，（25±1）℃下培養（48±2）h，培養后對黑色菌落進行計數[20-21]。每次測定3～4 組樣品。

1.3.3 微生物生長模型擬合

將大西洋鮭在4、10 ℃和25 ℃貯藏過程中測得的各項微生物數量分別采用修正的Gompertz模型[16,22]和Baranyi and Roberts模型[17,23]進行擬合，得到不同溫度下微生物數量與大西洋鮭貯藏時間的關系，即為微生物生長的一級模型，選擇最優公式擬合結果進行二級模型的建立。

修正的Gompertz模型見式（1）。

式中：t表示時間/h;N0表示最初菌落數（lg（CFU/g））;Nmax表示最大菌落數（lg（CFU/g））;lag表示生長延滯時間/h;μmax表示最大比生長速率/h-1。

Baranyi and Roberts模型見公式（2）。

式中：ymax表示微生物數達到穩定時的最大值（lg（CFU/g））;μmax、μ0分別表示最大比生長速率/h-1、比生長速率/h-1，當ymax＞＞y0時，μmax=μ0;h表示適應因素;t表示時間/h。

在一級模型的基礎上，采用Belehradek方程（平方根模型）[24]作為二級模型反映溫度和微生物生長速率以及生長延滯時間之間的關系，具體見公式（3）、（4）。

式中：bλ、bμ為方程系數;λ表示微生物生長延滯時間/h;T代表貯藏溫度/℃;Tmin是一個假設的概念，指的是微生物沒有代謝活動時的溫度，或者是最大比生長速率時的溫度。Tmin通過延長回歸線與溫度軸相交得到，此時最大比生長速率為0。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用Excel 2003軟件和OriginPro 8.0軟件分別進行數據處理和作圖，并選擇合適的模型對數據進行回歸分析。選用Visual Basic（VB6 Mini）軟件作為微生物生長預測程序編寫工具。

2 結果與分析

2.1 恒溫貯藏過程中大西洋鮭菌落總數、假單胞菌及希瓦氏菌生長預測方程

圖 1 修正的Gompertz模型（A）和Baranyi and Roberts模型（B）擬合大西洋鮭25 ℃貯藏期間微生物數量變化情況Fig. 1 Evolutionary curves of microorganism counts on Atlantic salmon stored at 25 ℃ fitted to modified Gompertz model (A) as well as Baranyi and Roberts models (B)

利用修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型對25 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數、假單胞菌數量和希瓦氏菌數量隨時間的變化情況進行擬合，結果如圖1所示。兩種模型擬合曲線相似度較高，其中，修正的Gompertz模型擬合曲線從生長期進入平臺期的過程更為平緩。擬合所得具體參數如表1所示，不同模型的擬合效果可由決定系數（R2）反映，R2越接近1，說明公式與微生物生長情況擬合程度越好。結果顯示修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型都能夠較好地擬合三類微生物的生長情況，但修正的Gompertz模型在擬合25 ℃貯藏大西洋鮭的假單胞菌生長延滯時間時出現負值，不符合已知微生物生長規律，Baranyi and Roberts模型擬合結果能夠更好地反映25 ℃貯藏大西洋鮭中的微生物生長情況。

圖 2 修正的Gompertz模型（A）和Baranyi and Roberts模型（B）擬合大西洋鮭10 ℃貯藏期間微生物數量變化情況Fig. 2 Evolutionary curves of microorganism counts on Atlantic salmon stored at 10 ℃ fitted to modified Gompertz model (A) as well as Baranyi and Roberts models (B)

圖 3 修正的Gompertz模型（A）和Baranyi and Roberts模型（B）擬合大西洋鮭4 ℃貯藏期間微生物數量變化情況Fig. 3 Evolutionary curves of microorganism counts on Atlantic salmon stored at 4 ℃ fitted to modified Gompertz model (A) as well as Baranyi and Roberts models (B)

10 ℃和4 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數、假單胞菌數量和希瓦氏菌數量隨時間的變化情況擬合結果分別如圖2、3所示，修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型擬合曲線基本一致。因此，結合25 ℃擬合結果，更適合反映微生物數量與大西洋鮭貯藏時間關系的一級模型為Baranyi and Roberts模型。

結合3 個溫度兩種模型擬合所得參數（表1），可以看出溫度對微生物的延滯期以及最大比生長速率影響顯著。隨著貯藏溫度的下降，微生物生長的延滯期延長，最大比生長速率下降：25 ℃貯藏時微生物的生長延滯時間都在7 h以內，最大比生長速率均在0.1 h-1以上;10 ℃貯藏時微生物的生長延滯時間約在20～35 h之間，最大比生長速率在0.08 h-1左右，4 ℃貯藏時微生物生長延滯期均在60 h以上，最大比生長速率在0.03 h-1左右。與丁婷[25]的研究結果相比，本實驗擬合所得微生物生長延滯期更長，最大比生長速率更小，推測原因為本實驗所用大西洋鮭為活魚處理，新鮮程度更高，初始菌落總數相較于丁婷等的研究結果減少了1（lg（CFU/g））以上。Teleken等研究了Richards模型擬合魚肉中假單胞菌的生長，結果同樣發現魚肉的初始假單胞菌數量和最終假單胞菌數量在不同貯藏溫度下差別不大，溫度主要影響微生物的最大比生長速率與延滯期[26]，所得結果與本實驗較為接近。

表 1 不同貯藏溫度下微生物生長參數擬合結果Table 1 Fitting parameters for microbial growth at different storage temperatures

2.2 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長二級模型擬合

Baranyi and Roberts模型較為準確地擬合出了4、10、25 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數、假單胞菌數量以及希瓦氏菌數量變化情況，但是無法反映其他溫度下3 類微生物的生長，因此需要建立微生物生長參數與溫度之間的關系，采用Belehradek方程（平方根模型）進行大西洋鮭貯藏溫度與微生物生長延滯時間、最大比生長速率之間的關系擬合。

表 2 Belehradek方程擬合大西洋鮭貯藏過程中微生物生長參數Table 2 Parameters for microbial growth on Atlantic salmon during storage fitted to Belehradek equation

從表2可以看出，Belehradek方程擬合不同溫度下大西洋鮭貯藏過程中的菌落總數、假單胞菌、希瓦氏菌生長參數的結果較好，具體方程分別見式（5）～（7），決定系數R2均大于0.9。

2.3 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測模型的驗證結果

表 3 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測模型驗證Table 3 Verification of microbial growth prediction model for Atlantic salmon during storage

為貼近實際應用，以GB 10136—2015中規定的生食制的動物性水產制品的菌落總數最高限量附近測定結果進行驗證，比較預測值與實測值，計算相對誤差[27-28]。驗證溫度除4、10、25 ℃外，還加入了在模型建立過程中未使用的15 ℃，以驗證模型在未知溫度下預測結果的準確性。驗證結果如表3所示，菌落總數在不同溫度下的預測值與實測值之間相對誤差較小，均在10%以內，表明該預測模型能夠較好地預判大西洋鮭在物流及貯運過程中微生物的生長情況[29]。假單胞菌和希瓦氏菌數預測值和實際值之間的相對誤差在20%以內，略高于菌落總數，推測原因為不同貯藏溫度對假單胞菌和希瓦氏菌生長的影響較大[30]，而菌落總數為大量微生物累積結果，受溫度影響較小。

2.4 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測系統建立

三級模型基本上是微生物生長預測模型的最終形式，是一個或多個一級、二級模型整合而成的應用程序，模型最終會并入計算機軟件的功能當中，使得用戶無需了解建模技術或基礎的一級和二級模型，從而使其成為一種在食品工業和研究中更容易獲取和使用的工具[15]。本研究選用Visual Basic軟件作為大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測軟件的程序編寫工具，設定軟件基本界面及算法后生成應用程序，方便使用。

圖 4 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測軟件使用界面Fig. 4 Operation interface of the microbial growth prediction software

軟件使用的界面如圖4所示，設定可預測微生物種類為“菌落總數”、“假單胞菌”和“希瓦氏菌”，可在combo下拉框中選擇想要預測的微生物種類，填寫貯藏溫度/℃、貯藏時間/h及初始微生物數量/（CFU/g）后，單擊“當前微生物數量及生長趨勢”，即可在圖4中右方看到該貯藏溫度下微生物的生長曲線。曲線中紅色圈出點為該貯藏時間點微生物數量（目標預測點），且數值會出現在文本框中，不僅幫助用戶得知微生物數量，也通過生長曲線的呈現方便用戶整體感知該貯藏溫度下微生物的生長情況，完成對未來生長態勢的預判，以采取相應的措施。該軟件程序部分已完成計算機軟件著作權登記。

3 結 論

對4、10、25 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數、假單胞菌數量及希瓦氏菌數量進行測定，利用修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型進行變化趨勢的非線性擬合，發現Baranyi and Roberts模型擬合準確度較高且符合實際情況，有利于二級模型的搭建，因此選擇Baranyi and Roberts模型作為反映恒溫貯藏過程中微生物數量與時間關系的模型，不同溫度下3 類微生物的擬合結果的R2達到0.9以上。

為了預測不同貯藏溫度下微生物的生長情況，利用Belehradek方程（平方根模型）進行大西洋鮭貯藏溫度與微生物生長延滯時間、最大比生長速率之間的關系擬合，獲得了大西洋鮭貯藏溫度與微生物生長參數之間的計算公式，從而完成對4～25 ℃區間內不同貯藏溫度下3 類微生物的生長預測。

通過Visual Basic軟件編寫大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預測程序，將Baranyi and Roberts模型和Belehradek方程擬合所得的參數帶入相應公式，獲得了不同貯藏溫度下大西洋鮭中3 類微生物的生長模型，用Visual Basic語言進行編寫、生成程序，可以達到用戶輸入基本貯藏條件后即可獲得微生物數量及生長曲線的目標。