氯化鈣處理對菠蘿采后黑心病及貯藏品質的影響

谷 會，朱世江，侯曉婉，賈志偉，張魯斌,*

（1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，海南省熱帶園藝產品采后生理與保鮮重點實驗室，廣東 湛江 524091;2.華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

菠蘿（Ananas comosus(L.) Merr.）原產于中、南美洲熱帶地區，是僅次于香蕉、芒果的世界第三大熱帶水果，菠蘿在我國為熱帶和亞熱帶地區四大名果之一，2016年我國菠蘿種植面積和產量分別為6.17萬 hm2和158.2萬 t，位居世界前十，其中82%以上的種植面積集中于廣東和海南，菠蘿的種植效益和出口貿易情況直接關系到果農的經濟收入[1]。然而，目前仍有諸多問題影響著我國菠蘿現代化和產業化發展，其中黑心病是菠蘿采后面臨的主要問題之一。黑心病是一種采后生理性病害，幾乎所有菠蘿品種都易感該病，通常是小果先出現半透明的水漬狀或褐色小斑點，隨著病情加深，褐色斑點互相聯結成一片，并向果軸發展，最終菠蘿果心均變為黑褐色，果實品質下降，失去商品價值，給農民、加工企業等造成巨大的經濟損失。因此，開展安全高效、綠色環保的菠蘿黑心病防控及采后品質維持技術研究有著重要的現實意義。

目前已報道的有脫落酸處理[2]、果蠟處理[3]、抗壞血酸處理[4]、熱處理[5-6]等方法均可降低采后菠蘿黑心病的發生，但這些方法延緩黑心病發生的效果并不顯著或者很難在生產上推廣應用。氯化鈣具有維持果實細胞壁與細胞膜結構功能的作用，還有調控果實離子環境與酶活性等生理功能，也是一種符合綠色環保要求的保鮮處理劑，已廣泛應用在果實的采后貯藏中，目前報道的主要用于蘋果[7]、梨[8]、棗[9-10]等果實貯藏保鮮中，可保持果實的硬度、延緩成熟衰老、減輕果實褐變。也有報道用采前氯化鈣噴霧處理[11]或采后氯化鈣浸泡果柄處理[12-13]來防治采后菠蘿黑心病，但防治效果不明顯，而且沒有系統闡明氯化鈣防治菠蘿黑心病的生理機制。本實驗即以此為切入點，研究氯化鈣處理對菠蘿采后黑心病及其貯藏品質的影響，并對其生理機制進行探討，為菠蘿采后黑心病防控以及品質維持提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菠蘿品種為‘巴厘’菠蘿（Ananas comosus‘Comtede Paris’），采摘于廣東省湛江市徐聞縣菠蘿實驗基地，采摘時每個菠蘿保留2 cm長的果柄，采收后立即運回南亞熱帶作物研究所實驗室備用。

無水氯化鈣 天津市福晨化學試劑廠;2,6-二氯酚靛酚 美國Sigam-Aldrich公司;蒽酮 上海國藥集團化學試劑有限公司;愈創木酚 天津光復精細化工有限公司;福林-酚 合肥博美生物技術有限公司;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AA700型原子吸收光譜儀 美國PerkinElmer公司;VC800型超聲波細胞粉碎儀 美國Sonics & Materials公司;UV-2700紫外-可見分光光度計 日本島津公司;Envolution RC型超速離心機 美國Thermo Fisher公司;MaxQ 8000型臥式搖床 美國Thermo Scientific公司;MIR-553型低溫恒溫培養箱 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿果實的前處理

挑選無病蟲害、無機械損傷、果實大小一致、果眼平整、果皮全綠的七成熟果實，頂芽垂直向上，使菠蘿果柄分別在質量分數為0.5%、1%、2%的氯化鈣水溶液中浸泡處理2 d，浸泡處理在10 ℃的低溫恒溫培養箱中進行，以清水浸泡為對照，處理完后從恒溫箱中取出自然晾干，用厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋敞口包裝，置于18 ℃的恒溫培養箱中貯藏，每隔3 d取一次樣，并計算黑心病的病情指數和防治效果。取樣部位為菠蘿黑心病的始發部位，即菠蘿果軸周圍的果肉，用于測定菠蘿采后品質及生理生化指標，每個處理5 個果實，重復3 次。

1.3.2 菠蘿黑心病病情指數的測定

菠蘿果實黑心病嚴重程度調查參照侯曉婉等[4]的方法，按果實縱剖面上褐變所占面積大小分為0～5級。0級：無褐變;1級：褐變面積占剖面面積的10%以下;2級：褐變面積占剖面面積的11%～20%;3級：褐變面積占剖面面積的21%～30%;4級：褐變面積占剖面面積的31%～50%;5級：褐變面積占剖面面積超過50%。菠蘿果實病情指數按公式（1）計算，氯化鈣處理對菠蘿黑心病的防治效果按公式（2）計算。

1.3.3 菠蘿果實采后品質指標的測定

本實驗選擇質量分數1%氯化鈣處理和對照的菠蘿樣品進行品質及生理生化指標測定。菠蘿果肉可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[14]，取0.3 g菠蘿果肉，加入300 mL蒸餾水進行冰浴勻漿，8 000×g、25 ℃離心10 min后取上清液進行測定，用葡萄糖作標準曲線，得線性回歸方程為：y=8.55x-0.07（x表示葡萄糖的質量濃度/（mg/mL）;y表示A620nm），決定系數R2=0.998，可溶性糖含量單位為mg/g。

菠蘿果肉可滴定酸質量分數用酸堿中和滴定法[15]進行測定，用體積分數1%酚酞作指示劑，以檸檬酸質量進行折算，折算系數為0.064。

菠蘿果肉VC含量的測定采用2,6-二氯酚靛酚滴定法。將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取2 g裝入離心管，用20 mg/mL草酸溶液浸提10 min，8 000×g、25 ℃離心10 min后取上清液用于測定，VC含量單位為mg/100 g。

菠蘿果肉水溶性總鈣含量采用原子吸收法[16]進行測定，將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取2 g置于50 mL離心管中，加入0.05 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液20 mL，用6 mm的超聲探頭在25 ℃下超聲粉碎20 min，10 000×g、25 ℃離心10 min，取上清液，用原子吸收光譜儀測定442 nm波長處的吸光度，用碳酸鈣來制作標準曲線，得線性回歸方程為：y=1.19x-0.021（x表示碳酸鈣含量/（mg/g）;y表示吸光度），決定系數R2=0.998，水溶性總鈣含量單位為mg/g。

1.3.4 菠蘿果肉PAL、PPO活力和總酚含量的測定

菠蘿果肉苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力的測定參考吳芳芳等[17]的方法，將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取1 g用于測定，提取介質為0.05 mol/L pH 8.8硼酸緩沖液，于290 nm波長處測OD值，以每分鐘OD290nm改變0.01為一個酶活力單位（U），PAL活力單位為U/g。

菠蘿果肉多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力測定參考Zhang Zhanquan等[18]的方法，將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取1 g樣品，提取介質為0.05 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液，于398 nm波長處測OD值，每分鐘OD398nm改變0.01為一個酶活力單位（U），PPO活力單位為U/g。

總酚含量采用福林-酚法[19]測定。將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取0.5 g用體積分數1%鹽酸-甲醇溶液浸提。以沒食子酸繪制標準曲線，得回歸方程為：y=79.2x-0.003 3（R2=0.996 5）（x表示沒食子酸質量濃度/（mg/mL）;y表示A765nm），結果表示為每100 g鮮樣中含沒食子酸的等效物的質量，總酚含量單位為mg/100 g。

1.3.5 菠蘿果肉POD活力、總抗氧化能力和水溶性胞內鈣含量的測定

菠蘿果肉過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照谷會等[20]的方法，稍有改動。將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取1 g用于測定，提取介質為0.05 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液，于470 nm波長處測定其吸光度，記錄1.5 min內吸光度的變化，以每分鐘升高0.1為一個酶活力單位（U），POD活力單位為U/g。

菠蘿果肉總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）采用T-AOC試劑盒測定，取0.3 g菠蘿果肉，加入3 mL提取液進行冰浴勻漿，10 000×g、4 ℃離心10 min后取上清液進行測定，T-AOC單位為U/g。

菠蘿果肉水溶性胞內鈣含量采用原子吸收法[16]進行測定，將菠蘿果肉冰浴研磨，稱取2 g置于50 mL離心管中，加入0.05 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液20 mL，在25 ℃、200 r/min下恒溫振蕩20 min，10 000×g、25 ℃離心10 min，取上清液，用于菠蘿果肉水溶性胞外鈣含量的測定，水溶性總鈣含量的測定同1.3.3節的方法，菠蘿果肉水溶性胞內鈣含量按公式（3）計算。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復3 次，結果均以鮮質量計。采用Excel 2010軟件統計所有數據，計算平均值和標準差并制圖;數據的方差分析采用SPSS 22.0軟件，利用Duncan’s多重比較對數據的顯著性差異進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氯化鈣處理對菠蘿采后黑心病病情指數的影響

圖 1 氯化鈣處理對菠蘿黑心病病情指數的影響Fig. 1 Effect of calcium chloride treatment on disease index of pineapple internal browning

由圖1可以看出，菠蘿果實在18 ℃下貯藏3 d，處理組和對照組均未發生黑心病，所有組均從第6天開始發病，0.5%氯化鈣處理組的病情指數在貯藏第6天和第9天與對照組均無顯著性差異，貯藏第12天顯著低于對照組（P＜0.05）。在貯藏6、9、12 d后，1%氯化鈣處理組的病情指數分別為17.3、22.7、46.7，防治效果分別為27.6%、48.4%、25.8%;2%氯化鈣處理組的病情指數分別為15.7、19.7、49.8，防治效果分別為34.3%、55.2%、20.6%。1%、2%氯化鈣處理組的病情指數顯著低于對照組，但兩個處理組的病情指數之間無顯著性差異。因此選擇1%氯化鈣處理進行其他指標的測定。

2.2 氯化鈣處理對菠蘿果實貯藏品質的影響

由圖2A可知，氯化鈣處理可明顯延緩菠蘿貯藏后期可溶性糖含量的下降，尤其在貯藏第9、12天，對照組的可溶性糖含量分別為91.7 mg/g和90.3 mg/g，而處理組分別為110.5 mg/g和98.1 mg/g，顯著高于對照組（P＜0.05）。

由圖2B可知，在整個貯藏期間，可滴定酸質量分數呈緩慢上升趨勢，而氯化鈣處理對可滴定酸質量分數的影響不大，對照組從貯藏初期的0.55%上升為貯藏末期的0.68%，而處理組從0.55%上升到0.75%。

由圖2C可知，氯化鈣處理可明顯延緩菠蘿貯藏后期VC含量的下降，尤其在貯藏的第9、12天，對照組的VC含量分別為15.7 mg/100 g和16.9 mg/100 g，而處理組分別為30.9 mg/100 g和22.9 mg/100 g，顯著高于對照組（P＜0.05）。

由圖2D可知，對照組和處理組果實的水溶性總鈣含量均呈先上升后下降趨勢，對照組在貯藏第9天達到最大值（2.9 mg/g），而處理組則在第3天就達到峰值（3.2 mg/g），對照組和處理組均在第12天下降到最低值，分別為2.5 mg/g和2.9 mg/g，在整個貯藏期間，氯化鈣處理組的水溶性總鈣含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖 2 氯化鈣處理組對菠蘿果實可溶性糖（A）、可滴定酸（B）、VC（C）、水溶性總鈣（D）水平的影響Fig. 2 Effect of calcium chloride treatment on the contents of soluble sugar (A), titratable acid (B), VC (C) and water soluble total calcium (D)in pineapple fruit

2.3 氯化鈣處理對菠蘿果實貯藏期間酚類物質代謝的影響

2.3.1 氯化鈣處理對菠蘿果肉PAL活力的影響

由圖3A可以看出，菠蘿果實在貯藏期間，PAL活力呈先下降后上升趨勢，對照組在貯藏6 d時的PAL活力為11.4 U/g，貯藏6 d后則大幅上升，到第12天達到最大值28.6 U/g。與對照相比，氯化鈣處理延緩了PAL活力的上升，處理組菠蘿果實在貯藏第6、9、12天的PAL活力分別為7.7、13.6、20.6 U/g，顯著低于對照組（P＜0.05）。

由圖3B可知，對照組果實的PPO活力呈先上升后下降趨勢，在貯藏3 d時達到峰值239.0 U/g，之后一直下降，到12 d下降到最低值168.2 U/g。而氯化鈣處理組的PPO活力則一直呈下降趨勢，從最初的178.3 U/g下降到貯藏12 d時的138.6 U/g，在整個貯藏過程中，氯化鈣處理組的PPO活力顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖 3 氯化鈣處理對菠蘿果實PAL（A）、PPO（B）活力的影響Fig. 3 Effect of calcium chloride treatment on PAL (A) and PPO (B)activity of pineapple fruit

2.3.2 氯化鈣處理對菠蘿果肉總酚含量的影響

圖 4 氯化鈣處理對菠蘿果實總酚含量的影響Fig. 4 Effect of calcium chloride treatment on total phenol content of pineapple fruit

由圖4可知，在整個貯藏過程中菠蘿果實總酚含量呈先下降后上升趨勢，氯化鈣處理組總酚含量在貯藏6 d時最低，為18.1 mg/100 g，對照組果實的總酚含量在貯藏3 d時最低，為19.4 mg/100 g，之后均呈上升趨勢。處理組和氯化鈣對照組貯藏12 d時分別上升到23.7 mg/100 g和31.7 mg/100 g，氯化鈣處理延緩了總酚含量的上升，貯藏12 d時比對照組下降了8.0 mg/100 g。

2.4 氯化鈣處理對菠蘿果實貯藏期間抗氧化能力的影響

2.4.1 氯化鈣處理對菠蘿果肉POD活力、T-AOC的影響

圖 5 氯化鈣處理對菠蘿果實POD活力（A）和T-AOC（B）的影響Fig. 5 Effect of calcium chloride treatment on POD activity (A) and T-AOC (B) of pineapple fruit

由圖5A可以看出，對照組和氯化鈣處理組的POD活力均呈先上升后下降趨勢，氯化鈣處理顯著提高了POD的活力（P＜0.05），在貯藏6 d時氯化鈣處理組POD活力最高，達30.4 U/g，是此時對照組的1.7 倍，貯藏12 d后氯化鈣處理組下降為21.2 U/g，是此時對照組的1.3 倍，而對照組的POD活力在整個貯藏過程中變化不大。

由圖5B可以看出，處理組和對照組菠蘿果實的T-AOC在貯藏前3 d無顯著性差異，而在貯藏6、9、12 d后，對照組的T-AOC分別為52.0、66.2、76.8 U/g，而氯化鈣處理組的T-AOC分別為79.4、98.7、92.2 U/g，顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.4.2 氯化鈣處理對菠蘿果肉水溶性胞內鈣含量的影響

圖 6 氯化鈣處理對菠蘿果實水溶性胞內鈣含量的影響Fig. 6 Effect of calcium chloride treatment on water-soluble intracellular calcium content of pineapple fruit

由圖6可知，氯化鈣處理組和對照組菠蘿果實的水溶性胞內鈣含量均呈先上升后下降趨勢，從貯藏初期的0.43 mg/g分別上升到第9天的最大值1.18 mg/g和0.75 mg/g，貯藏12 d時分別下降到1.08 mg/g和0.60 mg/g，在整個貯藏期間，氯化鈣處理組的水溶性胞內鈣含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

果蔬褐變從本質上可分為非酶促褐變和酶促褐變，非酶促褐變是由各種非酶原因引起化學反應導致的褐變，酶促褐變是果蔬組織體內的酚類物質在酶的作用下氧化成醌類，醌類再聚合形成褐色物質，從而導致組織變色，酚類物質、酚酶和活性氧是產生酶促褐變的3 個必要條件，眾多研究表明果蔬褐變以酶促褐變為主[21]。Dong Yu等[22]研究表明，低溫冷藏過程中‘黃冠’梨果皮褐變產生的主要原因是果皮Ca2+的流失、果皮活性氧含量的增加、細胞膜的損傷等導致PPO酶促反應增強，果皮酚類物質加劇氧化。本實驗也得到類似研究結果，菠蘿果實采后黑心病的發生與果實的活性氧代謝、酚類物質代謝、水溶性鈣含量有關。

氯化鈣處理可提高菠蘿果實的抗氧化性，降低由活性氧積累引起的細胞膜氧化損傷，從而抑制黑心病的發生。菠蘿果實的抗氧化能力和黑心病的發生密切相關，Luengwilai等[23]通過對菠蘿黑心病的抗病品種和感病品種對比研究發現，菠蘿果實的抗氧化能力可作為黑心病發生的標志性指標。正常情況下，植物體內活性氧的產生與清除處于動態平衡，如果動態平衡被打破，活性氧或過氧化自由基大量生成，膜脂過氧化加劇，細胞膜系統破壞，PPO與酚類物質接觸從而導致褐變發生，果蔬的成熟衰老過程也一樣，由于防御酶系統的抗氧化能力下降，大量活性氧或過氧化自由基積累，最終表現為果蔬組織氧化褐變，品質下降[24]。鈣參與調節多種植物滲透脅迫和保護酶體系的生理活動，外源鈣通過對植物抗氧化酶的影響從而提高植物的抗氧化能力[25]。龔偉等[26]研究表明，適宜濃度的外源鈣處理能使細胞內超氧化物歧化酶、POD、過氧化氫酶等防御酶的活力增加，降低胞內過氧化氫水平，降低細胞膜的電解質滲透率，穩定細胞質膜結構，從而延緩了果蔬的成熟衰老和褐變。外源鈣處理可提高多種果實的抗氧化性：Youryon等[13]研究發現氯化鈣處理可提高菠蘿果實的抗氧化能力，減輕黑心病的發生;外源鈣處理可以提高采后桃果實活性氧代謝水平，減輕桃果實果心褐變程度[27];POD是一種抗氧化防御酶，清除細胞內的活性氧，王艷穎等[28]研究表明，經氯化鈣處理的李果實POD活力是對照組果實的3.7 倍，酶促褐變明顯減輕。本實驗也得出同樣的結論，氯化鈣處理提高了POD活力、T-AOC，從而減輕了細胞膜脂過氧化損傷，抑制了菠蘿黑心病的發生。另一方面，本實驗還發現氯化鈣處理提高了果實VC的含量，菠蘿果實內VC含量的高低和黑心病的發生密切相關，VC可作為一種抗氧化劑，有較強的還原性，能使酚酶失活，又能消耗活性氧，可有效抑制酚類物質的氧化褐變[23]。

氯化鈣處理影響了果實酚類物質的代謝，表現為抑制了酚類物質的氧化和合成，從而減輕了褐變產生。PPO是一種可將酚類物質氧化為黑褐色醌類化合物的酶，菠蘿果實PPO活力和菠蘿黑心病的嚴重程度直接相關，低溫可以誘導PPO活力增強，從而導致菠蘿黑心病的發生[29]。Stewart等[30]研究表明，發生黑心病的菠蘿果實PPO活力是未發生黑心病果實的10 倍。張澤杰等[31]研究發現，外源鈣處理可以降低‘肥城桃’桃果實PPO的活力，從而減輕褐變及軟化的發生。同樣，本研究也發現氯化鈣處理可降低果實PPO的活力，抑制黑心病的發生。PAL是酚類生物合成的關鍵酶，與果實褐變有關。PAL活力高低與菠蘿黑心病的關系目前說法不統一，Zhou Yuchan等[32]研究發現，低溫環境提高了菠蘿果實中的PAL活力，刺激酚類物質的生物合成并使菠蘿產生褐變。Youryon等[13]認為，2%的氯化鈣處理可以降低菠蘿果實的黑心病，PAL活力在貯藏后期低于對照組，貯藏前期則高于對照組。而Selvarajah等[33]則認為PAL活力與菠蘿黑心病發生沒有直接關系。本研究結果表明，氯化鈣處理在貯藏前后均降低了果實PAL的活力，降低了果實總酚的含量，從而抑制了黑心病的發生。

氯化鈣處理可提高水溶性胞內鈣的含量，抑制菠蘿黑心病的發生。采后菠蘿黑心病發病的原因比較復雜，同一品種可以在10 ℃甚至更低的溫度下發生黑心病，這可能和菠蘿發生冷害有關，也可以在20 ℃甚至更高的溫度下發生黑心病，這和菠蘿的成熟衰老有關[2]。本實驗研究的菠蘿是在18 ℃下貯藏，黑心病的發生也可能是一種衰老的表現。Ca2+作為植物細胞內外信息傳遞的第二信使，可調節植物諸多生長和發育過程，對果實成熟衰老也有調控作用，Ca2+通常被認為是植物細胞衰老和果實后熟作用的延緩劑[34]。在果實成熟衰老過程中，水溶性Ca2+含量呈下降趨勢，提高Ca2+含量可延緩果實衰老[35]。Hewajulige等[36]對黑心病感病菠蘿研究發現，黑心病的嚴重程度和果實水溶性鈣含量呈負相關，靠近菠蘿果心的果肉鈣含量較低，褐變嚴重，而靠近果皮的果肉鈣含量較高，褐變較輕。而本實驗得出相反的研究結果，對照組菠蘿果實隨著黑心病發病加重，而水溶性胞內鈣的含量有小幅上升趨勢，這可能和果柄浸泡清水而產生水分脅迫并觸發胞內鈣濃度上升有關。而經氯化鈣處理的菠蘿果實水溶性胞內鈣含量上升幅度明顯高于對照組，黑心病病情指數明顯低于對照組，說明氯化鈣處理可以通過提高果實水溶性胞內鈣的含量而延緩果實衰老，抑制黑心病的發生。

總之，采后1%的氯化鈣處理明顯降低了菠蘿黑心病的病情指數，首先是由于其提高了POD的活力、VC的含量、T-AOC，從而減輕了細胞膜的氧化損傷;其次，氯化鈣處理降低了果實PAL和PPO的活力，降低了果實總酚的含量;再次，氯化鈣處理可提高果實水溶性胞內鈣的含量，減輕果肉褐變的發生。此外，采后1%的氯化鈣處理還延緩了菠蘿采后貯藏品質的劣變，延緩了果實VC、可溶性糖含量的下降，提高了果實水溶性總鈣的含量。