褪黑素采前噴施對采后番茄果實抗病性和貯藏品質的影響

生吉萍，趙瑞瑞，陳玲玲，申 琳,*

（1.中國人民大學農業與農村發展學院，北京 100872;2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

果蔬是重要的經濟作物，同時也是重要的食物來源，其在生長發育、采后貯藏保鮮過程中容易受到病原微生物侵染。據統計，病原菌每年大約造成全球農作物產量損失15%[1]，同時也會產生食品安全問題?；移咸焰呔˙otrytis cinerea）是最常見的真菌病原菌之一，寄主范圍非常廣泛，能夠感染200余種作物，對作物的花、葉、果實等部位造成侵染性病害，嚴重危害著果蔬的生長發育過程和采后貯藏保鮮。

番茄是世界上重要的經濟作物之一，在生長發育和采后貯藏中容易受到灰葡萄孢菌侵染，目前，防治番茄病害最普遍有效的方法是化學殺菌，但化學殺菌劑的頻繁使用不僅使果蔬產生耐藥菌，也使得農藥殘留量逐漸增加，嚴重危害人類健康和生態環境[2]。隨著人民生活品質的提高，食品安全和環境污染問題日益受到關注，開發更加安全、環保的病害防控方法成為當務之急。

褪黑素的化學名稱是N-乙?；?5-甲氧基-色胺，因其在動物中是由大腦的“松果體腺”分泌的一種激素，又被叫作松果體素。褪黑素廣泛存在于生物體中，是動植物、微生物進化過程中一種保守的分子。1995年，人們首次在植物中檢測到褪黑素[3]。隨后的研究發現，褪黑素普遍存在于高等植物的根、莖、葉、花、果實和種子中，其含量很低，通常每克組織樣品含褪黑素的質量數量級為pg～ng[4-6]。研究表明，褪黑素不僅在植物根、莖等器官的發育過程中發揮作用，還在植物頂端優勢、開花、衰老等過程中發揮重要作用。在生物和非生物脅迫方面，褪黑素在植物清除活性氧自由基，抗鹽、高溫、干旱、紫外線、重金屬和化學藥劑等逆境脅迫中起著重要的作用，除此以外，褪黑素還能提高蘋果樹抗褐斑病、擬南芥抗PstDC3000病原菌侵染的能力;但褪黑素在采前果實中應用與機理研究還鮮見報道。

本研究以褪黑素采前噴施番茄植株，研究其對采后果實抗灰葡萄孢菌能力和品質的影響，為實際種植中選擇適宜濃度褪黑素緩解番茄病害、提高果實的品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗于2017年7月在北京市通州番茄種植園區進行，供試材料為番茄植株（Solanum lycopersicumcv. Ailsa Craig），生長正常，管理水平良好。

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）購自中國農業微生物菌種保藏管理中心，ACCC編號36028，使用之前于PDA平皿中培養10 d，長有灰色孢子時使用。

褪黑素、幾丁質、蝸牛酶、昆布多糖、L-苯丙氨酸美國Sigma公司;抗壞血酸、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、Tween-80等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DW-YL270型-20 ℃低溫冰箱、DW-HL340型-80 ℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司;高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;PB-10 pH計北京賽多利斯科學儀器有限公司;UV-1800紫外-可見光分光光度計 島津醫療器械（北京）有限公司;KHW-D-1恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;LX-B高壓滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司;CFX96實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將植株按照開花時間標記花期，于開花后15 d噴施處理，噴施時將大棚內隨機劃分為5 個區域，并將各組處理進行隔離。將褪黑素溶解于蒸餾水中，配制成1、50、100 μmol/L和150 μmol/L的溶液，對照組為蒸餾水處理組，不同濃度褪黑素和蒸餾水分別噴灑于全株番茄植株，每株噴施100 mL。每隔7 d噴一次，共噴4 次，待果實成長為綠熟期果實（開花之后45 d左右）后采收大小均勻、形狀和成熟度相對一致、無蟲害、無機械損傷的果實，運回實驗室。先放置12 h散去田間熱，再將果實在體積分數3%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min消毒，清水洗凈，晾干。每組選擇10 個番茄果實，進行損傷接種。

損傷接種參照Yu Wenqing等[7]的方法，稍作修改。在無菌條件下，用含體積分數0.01% Tween-80的無菌水將PDA平板上的灰霉病原菌孢子洗脫下來，漩渦振蕩，紗布過濾，用無菌水將孢子懸浮液的濃度調節至2×105～2×106CFU/mL備用。接種前，在超凈臺中用無菌的200 μL槍頭在果實赤道部4 個方向分別扎直徑2 mm、深度4 mm的小孔，然后注入10 μL的孢子懸浮液。接種后的番茄果實（25±1）℃、90%～95%相對濕度條件下貯藏，每天統計果實發病率和病斑直徑，得到最適濃度，然后測定最適濃度處理組和對照組的其他指標，其中抗病相關酶活力和基因相對表達量測定時分別在0、2、4、8、16、24、72、120、168 h取樣，營養指標測定在0、1、3、5、7 d取樣。本實驗重復兩次。

1.3.2 發病率及病斑面積測定

發病率和病斑面積分別按公式（1）、（2）進行計算。

式中：d表示病斑直徑/cm。

1.3.3 抗病酶活力測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、幾丁質酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力的測定參照曹建康等[8]的方法。以每小時每克樣品吸光度分別在290、420 nm波長處變化1為一個PAL、PPO活力單位（U），單位為U/g。以每秒鐘每克樣品中分解膠狀幾丁質產生1×10-9mol Glc-NAc為一個CHI活力單位，以每秒鐘每克樣品中酶分解昆布多糖產生1×10-9mol葡萄糖為一個GLU活力單位。以上酶活力單位均為U/g，結果以鮮質量計。

1.3.4 抗壞血酸、可溶性糖、可溶性蛋白、VC含量測定

抗壞血酸、可溶性糖、可溶性蛋白、VC含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。可溶性糖和可溶性蛋白含量的單位為mg/g，可滴定酸含量單位為g/100 g，VC含量單位為μg/g，結果均以鮮質量計。

1.3.5 抗病基因相對表達量測定

番茄果實總RNA提取、反轉錄和qPCR采用試劑盒方法進行。

番茄抗病相關基因PR1、NPR1、PI II和LoxD表達量分析參照Zhang Shujuan等[9]的方法進行，并加以修改。以SlACTIN7為內參基因，按照qPCR引物設計原則，參考表1設計特異性引物。

表 1 實時定量PCR的特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers used for quantitative polymerase chain reaction analysis

qPCR擴增體系為：1 μL cDNA樣品、5 μL 2×Mix、0.3 μL上下游引物，雙蒸水補至10 μL。CFX 96 qPCR儀中運行程序，擴增條件為：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環;95～60 ℃（16 s）條件下分析溶度曲線。每個cDNA樣品平行檢測3 次?；蛳鄬Ρ磉_量的計算應用2-△△Ct方法計算。

1.4 數據處理與分析

應用Excel 2011軟件統計分析所有數據，計算標準差并作圖。應用SPSS 18.0軟件對所有數據進行方差分析，利用鄧肯氏多重比較法對數據進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 采前褪黑素處理對采后番茄果實抗病性的影響

圖 1 采前褪黑素處理對番茄果實接種灰葡萄孢菌后發病情況的影響Fig. 1 Effect of pre-harvest melatonin treatment on the incidence of tomato fruit inoculated with Botrytis cinerea

如圖1A所示，不同濃度褪黑素處理組番茄果實的病斑面積均不同程度小于對照組。如圖1B所示，1、50、100、150 μmol/L褪黑素處理組在接種后3 d時的發病率比對照組分別低28.57%、28.81%、28.81%和57.14%（P＜0.05），6 d時的發病率分別比對照組低18.00%、21.66%、26.67%和36.00%（P＜0.05），隨褪黑素處理濃度的升高，果實發病率降低。如圖1C所示，接種3 d后，1、50、100、150 μmol/L褪黑素處理組的病斑面積比對照組分別低41.51%、52.03%、55.14%和58.50%（P＜0.05），6 d時的病斑面積比對照組分別低14.09%、22.61%、43.51%（P＜0.05）和5.94%。采前100 μmol/L褪黑素處理組在第6天的病斑面積最小，150 μmol/L褪黑素處理組的病斑面積與對照組無顯著性差異（P＜0.05）。綜上，采前適宜濃度的褪黑素噴施番茄植株，可以提高采后番茄果實的抗灰葡萄孢菌能力，其中100 μmol/L褪黑素處理效果最好。

2.2 采前褪黑素處理對采后番茄果實抗病相關酶活力的影響

圖 2 采前褪黑素處理對采后番茄果實抗病相關酶活力的影響Fig. 2 Effect of pre-harvest melatonin treatment on disease resistancerelated enzyme activities in postharvest tomato fruit

CHI是高等植物體內水解病原菌細胞壁幾丁質的酶，GLU能夠降解真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖，PPO能催化酚類物質形成具有直接殺菌能力的醌類化合物，PAL是苯丙烷類代謝過程中的關鍵酶和限速酶，能促進酚類、木質素和植保素等重要抗菌物質的合成[10-13]。如圖2A所示，采前褪黑素處理組番茄果實的CHI活力始終高于對照組，兩組活力均在貯藏7 d（168 h）時達到最大值。如圖2B所示，在采摘初期，褪黑素處理組果實的GLU活力高于對照組，在整個貯藏過程中，對照組和處理組的GLU活力都呈現先上升后波動下降的趨勢，均在2 h時出現活力高峰，處理組的GLU活力高峰值顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖2C所示，除了4 h時，在整個貯藏過程中，褪黑素處理組的果實PPO活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖2D所示，在0 h，褪黑素處理組PAL活力高于對照組，貯藏1 d時，對照組果實PAL活力到達最高值，處理組PAL活力處于最低值。之后的貯藏過程中，對照組果實的PAL活力逐漸下降，而處理組的活力逐漸上升。第7天時，處理組的GLU活力達到最高值，高于對照組最高值。以上結果表明，采前褪黑素處理提高了采后番茄果實CHI、GLU、PPO、PAL的活力。

2.3 采前褪黑素處理對采后番茄果實抗病相關基因表達量的影響

圖 3 采前褪黑素處理對采后番茄果實抗病相關基因表達量的影響Fig. 3 Effect of pre-harvest melatonin treatment on the gene expression associated with disease resistance in postharvest tomato fruit

病程相關蛋白受到病原菌侵染或非生物脅迫誘導時產生。NPR1是植物體內水楊酸、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）抗病信號傳導網絡的關鍵點，在水楊酸誘導的抗病途徑中起關鍵作用[14-15]。PI II基因是JA信號途徑上的一個重要基因[16]，而其活躍表達也說明抗病信號傳導與該途徑具有密切關系。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是茉莉酸途徑的關鍵酶和限速酶[17]。如圖3A所示，褪黑素處理組果實基因PR1相對表達量呈現先上升后下降的趨勢。在整個貯藏期內，褪黑素處理組果實PR1的相對表達量始終高于對照組，兩組基因相對表達量均在4 h時達到峰值，此時處理組的PR1基因表達量是對照組的2 倍。如圖3B所示，褪黑素處理組果實的NPR1相對表達量呈現先升高后下降的趨勢，對照組呈現波動降低的趨勢。在整個貯藏過程中，處理組果實的NPR1表達量略高于對照組。如圖3C所示，在貯藏的過程中，處理組果實的PI II相對表達量高于對照組，兩組均先增后降。如圖3D所示，在貯藏2 h時，兩組LoxD相對表達量都達到了峰值，褪黑素處理組的LoxD相對表達量峰值是對照組的4 倍。貯藏2 h之后，兩組的LoxD相對表達量都驟降且趨于平穩，褪黑素處理組的LoxD表達水平略高于對照組。

2.4 采前褪黑素處理對采后番茄果實品質的影響

VC、有機酸、可溶性糖和可溶性蛋白在植物的生物和非生物脅迫中發揮重要作用，且其含量是衡量果蔬營養品質的重要指標[18-24]。如圖4A所示，褪黑素處理組和對照組VC含量均隨貯藏時間延長呈現先上升后下降的趨勢，在整個貯藏過程中，處理組果實的VC含量始終顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖4B所示，處理組和對照組可滴定酸含量的變化范圍為0.27～0.40 g/100 g，均呈現逐漸上升的趨勢，從采收一直到貯藏7 d，處理組的可滴定酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖4C所示，對照組可溶性糖含量在貯藏期逐漸升高，0～1 d是緩慢上升期，1～5 d是快速上升期，5 d之后逐漸穩定;處理組在0 d時可溶性糖含量即高于對照組，0～1 d是快速增長期，之后趨于穩定，在貯藏過程中，處理組的可溶性糖含量均高于對照組。如圖4D所示，在貯藏過程中，處理組的可溶性蛋白含量呈現先上升后下降的趨勢，對照組呈現先下降后緩慢上升的趨勢。處理組和對照組可溶性蛋白含量的最高值分別在貯藏的1、0 d，且處理組的峰值略高于對照組，處理組可溶性蛋白含量在1 d和3 d時高于對照組。上述結果表明，采前褪黑素處理提高了采后番茄果實的貯藏品質。

圖 4 采前褪黑素處理對采后番茄果實品質相關指標的影響Fig. 4 Effect of pre-harvest melatonin treatment on quality indicators of postharvest tomato fruit

3 討 論

本實驗采用不同濃度褪黑素對開花之前的番茄植株進行采前噴施，以采后綠熟期番茄果實作為實驗材料。從實驗結果來看，外源褪黑素采前處理可以降低采后番茄果實灰霉病的發病率和病斑面積，其中100 μmol/L的采前褪黑素抗病效果最好。貯藏過程中，采前褪黑素處理能夠提高果實的PAL、CHI、GLU和PPO活力，并不同程度地提高抗病相關基因（PR-1、NPR1、PI II、LoxD）的相對表達量，可初步判斷褪黑素同時通過SA和JA/ET兩條途徑導致植物產生抗病性，但其誘導機制需要進一步的實驗驗證。

褪黑素處理采后果實能夠提高番茄[25]、草莓[26]的營養品質，同時研究表明，褪黑素采前處理番茄植株可以提高采后果實的質量，提高果實內部有機酸、VC的含量[27]，與本實驗發現用褪黑素采前處理能夠提高采后番茄果實的可溶性糖、可滴定酸、蛋白質含量、VC含量的結果相一致，說明褪黑素采前處理可以一定程度上改善采后番茄果實的品質。

綜上，在采前對番茄植株噴施適宜濃度褪黑素可有效提高采后番茄果實對灰葡萄孢菌的抗性、抗病相關酶活力和番茄的貯藏品質。