黃芥籽粕黃酮提取及其抗氧化活性

趙二勞 展俊嶺 楊 潔 趙三虎

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系， 忻州 034000)

黃芥籽為十字花科蕓薹屬植物芥菜型油菜黃芥(BrassicajunceaL.)的籽粒，我國主產(chǎn)于晉北、陜北、內(nèi)蒙、甘肅和青海等黃土高原地區(qū)，資源豐富[1]。黃芥籽顆粒較小，千粒質(zhì)量2.0～2.6 g，畝產(chǎn)可達(dá)100～150 kg，種植效益較好。其皮殼為黃色或棕黃至棕紅色，具有皮薄、色素少、含油量高以及纖維素含量低等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。目前，黃芥籽主要用于榨油，榨油后產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品黃芥籽粕，多用作農(nóng)肥或飼料，未進(jìn)行精深加工，科技附加值低下，利用效益不高，造成資源的極大浪費(fèi)。黃芥籽粕含有多糖、多酚及黃酮等功能活性成分，具有多種功能活性，在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用前景較好[4-7]。因此，研究黃芥籽粕中多糖、多酚及黃酮等功能成分的提取及其生物活性，對(duì)于提高黃芥籽粕科技附加值，有效拉長黃芥產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)黃芥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提升黃芥籽綜合利用效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，具有重要的實(shí)際意義。

目前，本課題組已就黃芥籽粕中多糖和多酚的提取及其一些功能活性進(jìn)行了研究[1,8]，但有關(guān)黃芥籽粕中黃酮的提取鮮見相關(guān)研究報(bào)道。同時(shí)基于超聲輔助提取技術(shù)的優(yōu)勢(shì)[9-10]，本實(shí)驗(yàn)研究黃芥籽粕中黃酮的超聲輔助提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化提取工藝，并采用清除DPPH·和·OH法測(cè)定其抗氧化活性，以期為黃芥籽粕中黃酮的提取及黃芥籽粕的高值化綜合開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃芥籽粕(粉碎過40目篩，經(jīng)石油醚脫脂后，烘干，保存?zhèn)溆?；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚 (BHT)、無水乙醇、水楊酸、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

723型可見分光光度計(jì)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器；SHZ-2D循環(huán)水式真空泵。

1.3 方法

1.3.1 黃芥籽粕黃酮的超聲輔助提取

工藝流程：預(yù)處理后黃芥籽粕粉→加入乙醇→超聲輔助提取→過濾→濾液定容→提取液。

主要工藝參數(shù)：預(yù)處理后黃芥籽粕粉2.0 g，提取次數(shù)1次，過濾后提取液均定容為100 mL，其余工藝參數(shù)按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.2 黃芥籽粕中黃酮得率的測(cè)定1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定[11-12]。在最大波長510 nm處測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A= 0.011 9C+0.003，R2=0.999 5，蘆丁質(zhì)量濃度C的線性范圍為0～72μg/mL。

1.3.2.2 黃芥籽粕黃酮提取得率的測(cè)定

準(zhǔn)確量取黃芥籽粕提取液3.0 mL，置于25 mL比色管中，按1.3.2.1的方法測(cè)定并計(jì)算提取液中黃酮質(zhì)量，按公式計(jì)算黃芥籽粕黃酮提取得率。

黃芥籽粕黃酮得率 = 提取黃酮質(zhì)量(mg)/黃芥籽粕質(zhì)量(g)

1.3.3 黃芥籽粕黃酮抗氧化活性

以清除DPPH·和·OH的IC50值為指標(biāo)，用抗氧化劑2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)為陽性對(duì)照，評(píng)價(jià)黃芥籽粕黃酮的抗氧化活性，IC50值越小，則其抗氧化活性越強(qiáng)。

1.3.3.1 黃芥籽粕黃酮對(duì)DPPH·的清除率

參考文獻(xiàn)[1,13]的方法稍作改動(dòng)，準(zhǔn)確量取6份1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的DPPH·溶液(無水乙醇配制)，分別置于10 mL比色管中，分別加入不同質(zhì)量濃度的黃芥籽粕黃酮提取液，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至刻度，充分搖勻，在室溫下，避光反應(yīng)30 min后，在波長517 nm 處分別測(cè)定其吸光度，按公式計(jì)算清除率。

清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為DPPH·溶液與一定黃芥籽粕黃酮溶液的吸光度；A2為僅黃芥籽粕黃酮溶液體系的吸光度，A0為僅DPPH·溶液體系的吸光度。

同法測(cè)定并計(jì)算BHT溶液的清除率。然后分別作黃芥籽粕黃酮和BHT溶液對(duì)DPPH·清除率曲線，對(duì)曲線線性回歸計(jì)算其IC50值，比較其抗氧化活性。

1.3.3.2 黃芥籽粕黃酮對(duì)·OH的清除率

參考文獻(xiàn)[1,14]的方法稍作改動(dòng)， 在10 mL的比色管中，分別加入1.0 mL濃度為1×10-3mol/L的FeSO4溶液、1.0 mL濃度為1×10-3mol/L的水楊酸溶液和1.0 mL濃度為0.1% H2O2溶液，再加入一定濃度的黃芥籽粕黃酮或BHT溶液，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至刻度， 40 ℃恒溫反應(yīng)40 min后，于最大波長510 nm處測(cè)定其吸光度，按公式計(jì)算清除率。

清除率= [1-(Ai-Aj)/Ax]×100%

式中：Ax為不加黃芥籽粕黃酮或BHT溶液體系的吸光度；Ai加入黃芥籽粕黃酮或BHT溶液體系的吸光度；Aj僅黃芥籽粕黃酮或BHT溶液體系的吸光度。

分別作黃芥籽粕黃酮和BHT溶液對(duì)·OH清除率曲線，對(duì)曲線線性回歸計(jì)算其IC50值，比較其抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)值均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。數(shù)據(jù)間P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。由圖1可知，固定超聲功率240 W、提取溫度40 ℃、料液比(g/mL)1∶20、提取時(shí)間30 min，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，黃芥籽粕中黃酮得率先增大后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值8.89 mg/g，再繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，黃酮得率下降。其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，會(huì)增加黃芥籽粕中其他醇溶性物質(zhì)溶出，影響黃酮類成分的溶出，導(dǎo)致黃芥籽粕黃酮得率降低[11]，因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

固定超聲功率240 W、提取溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、提取時(shí)間為30 min，料液比(g/mL)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時(shí)，隨料液比的增加，黃芥籽粕黃酮得率呈先增加后降低的趨勢(shì)。在料液比為1∶15(g/mL)時(shí)，黃芥籽粕中黃酮得率達(dá)到最大，為9.38 mg/g，之后隨料液比的增加，黃酮得率逐漸減小。可能原因是溶劑量的增加，有利于黃酮類成分的溶解及增大了溶液的傳質(zhì)推動(dòng)力，使黃酮得率增加；但料液比繼續(xù)增加，一方面影響超聲波輻射對(duì)黃芥籽粕作用的效率[1]，另一方面會(huì)增加一些其他成分溶出，影響黃酮類成分溶出[15，16]，導(dǎo)致黃酮得率下降，因此，選擇料液比(g/mL)為1∶15。

固定超聲功率240 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度40 ℃，提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，黃芥籽粕黃酮得率緩慢增加，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，黃酮得率達(dá)最大，為7.84 mg/g。以后隨提取時(shí)間的增加，黃酮得率下降。其原因可能是提取時(shí)間短，黃酮提取不充分；提取時(shí)間過長，在超聲波的作用下，會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，使黃酮得率下降[16]。因此，選擇提取時(shí)間為40 min。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間30 min，超聲功率分別為160、200、240、280、320、360 W時(shí)，隨超聲功率的增大，黃芥籽粕黃酮得率呈先增后降趨勢(shì)，但總體變化不大，在超聲功率為280 W時(shí)，黃酮得率達(dá)最大，為9.24 mg/g。因此確定超聲功率為280 W。

固定超聲功率240 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比(g/mL)1∶20，提取時(shí)間30 min，提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃時(shí)，隨提取溫度升高，黃芥籽粕黃酮得率呈先增后降趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為30 ℃時(shí)，黃芥籽粕黃酮得率達(dá)最大，為8.79 mg/g。黃酮得率逐漸下降，但變化不大。考慮能耗等問題[11]，確定提取溫度為30 ℃。

圖1 超聲輔助提取黃芥籽粕黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率280 W、提取溫度30 ℃，選取對(duì)黃芥籽粕黃酮提取得率影響較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)為因素，以黃酮提取得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取的最佳工藝。因素與水平見表1，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到黃芥籽粕黃酮得率對(duì)各因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=10.09+0.11A+0.18B+0.38C-0.30AB+0.08AC+0.07BC-0.34A2-0.33B2-2.14C2。對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的方差分析

注：P<0.01為差異極顯著；P<0.05為差異顯著。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design- Expert 8.0.6 軟件對(duì)回歸模型分析，得到黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取最佳工藝條件為：固定超聲功率280 W、提取溫度為30 ℃時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)70.57%，料液比(g/mL)1∶16.28，提取時(shí)間40.94 min。此工藝條件下，黃芥籽粕黃酮理論得率為10.134 mg/g。進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考查實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，為了實(shí)驗(yàn)操作便利，將工藝條件修正為：固定超聲功率280 W、提取溫度為30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為71%，料液比(g/mL)1∶16，提取時(shí)間41 min，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃芥籽粕黃酮平均得率為10.042 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.91%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 黃芥籽粕黃酮抗氧化活性

2.4.1 黃芥籽粕黃酮對(duì)DPPH·的清除率

黃芥籽粕中黃酮類成分對(duì)DPPH·的清除結(jié)果如圖2所示。在濃度范圍內(nèi)，黃芥籽粕黃酮提取液和BHT溶液對(duì)DPPH·的清除率都隨其濃度的增加而增大，量效關(guān)系明顯。分別對(duì)其清除率曲線進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得黃芥籽粕黃酮與BHT清除DPPH·的IC50分別為3.80、6.21 μg/mL，可見，黃芥籽粕黃酮對(duì)DPPH·的清除能力強(qiáng)于常用抗氧化劑BHT，表明黃芥籽粕黃酮具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，即具有強(qiáng)的抗氧化活性。

圖2 黃芥籽粕黃酮和BHT對(duì)DPPH·的清除率

2.4.2 黃芥籽粕黃酮對(duì)·OH的清除率

黃芥籽粕中黃酮類成分對(duì)·OH的清除結(jié)果如圖3所示。可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黃芥籽粕黃酮提取液和BHT溶液對(duì)·OH的清除率都隨其濃度的增加而增大，也具有明顯的量效關(guān)系。分別對(duì)其清除率曲線進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得黃芥籽粕黃酮與BHT清除·OH的IC50分別為2.18 μg/mL和5.87 μg/mL，顯見，黃芥籽粕黃酮對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)于常用抗氧化劑BHT，表明黃芥籽粕黃酮具有強(qiáng)的·OH清除能力，即黃芥籽粕黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖3 黃芥籽粕黃酮和BHT對(duì)·OH的清除率

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了黃芥籽粕中黃酮超聲輔助提取工藝，并采用清除DPPH·和·OH法測(cè)定了黃芥籽粕黃酮抗氧化活性。影響黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取得率的因素大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)。確定的黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，料液比(g/mL)1∶16，超聲功率280 W、提取溫度30 ℃，提取時(shí)間41 min。在此工藝條件下，黃芥籽粕黃酮得率為10.042 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值10.134 mg/g的相對(duì)誤差為0.91%。黃芥籽粕黃酮與BHT清除DPPH·的IC50分別為3.80 μg/mL和6.21 μg/mL；清除·OH的IC50分別為2.18、5.87 μg/mL。表明響應(yīng)面法優(yōu)化的黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取工藝穩(wěn)定可行，黃芥籽粕黃酮具有強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑開發(fā)應(yīng)用。