反膠束對植物蛋白的結構、功能性和應用的影響研究進展

孫 雪 趙曉燕 朱運平 張曉偉 劉紅開 朱海濤

(濟南大學烹飪學院食品科學與營養系1,濟南 250022)

(北京工商大學食品學院2, 北京 102488)

植物蛋白是從植物中萃取的一類蛋白質，其來源廣泛，營養與動物蛋白相近，經過加工后不僅更容易被人體所吸收，而且由于植物蛋白膽固醇和飽和脂肪酸含量極低，所以較動物蛋白更加健康。此外，植物蛋白具有多種生理保健功能，如降低膽固醇、抗氧化和降血壓等[1]。傳統分離植物蛋白的方法有堿提酸沉法、雙向水相分離法、酶解法等，但缺點是萃取過程復雜、效率低、成本高、污染環境等，難以滿足現代工業化的需要。反膠束提取法是在20世紀80年間早期開發出用于分離和提純的技術，該方法具有選擇性高、能耗低、提取條件溫和、易工業化生產，并且能夠有效防止提取物失活和變性等優點，可廣泛應用于生物大分子，如氨基酸、蛋白質、核酸等的分離和純化[2]。目前，反膠束提取技術已應用于生物、化學、食品和醫藥等許多領域，具有廣闊的發展前景[2]。本文將從反膠束提取蛋白質的基本原理以及國內外有關反膠束體系提取植物蛋白質的研究現狀進行論述。

1 反膠束萃取法概述

正常膠束是指表面活性劑溶于水中的濃度高于臨界膠束濃度(CMC)時,聚合在一起形成的親水基向外、疏水基向內的聚集體[3]。反膠束是指油相中表面活性劑的濃度超過CMC后,其親水極性頭自發向內與水接觸，疏水非極性尾向外與非極性有機溶劑接觸所形成的具有熱力學穩定性和光學透明性的納米級聚合體(見圖1)。反膠束中有機溶劑包裹著水形成“水池”，具有溶解極性物質的特性，如氨基酸，酶和抗生素等，在提取過程中，生物大分子被包封在反膠束中，避免了與有機溶劑直接接觸而發生變性[4]。水溶性生物分子溶解在反膠束的“水池”中，稱為前萃(見圖2)；通過改變水相條件(例如pH、離子濃度等)使含有生物分子的前萃液與另一種水相接觸，將產物從反膠束移動到水相的流程稱為“后萃”[5]。

圖1 正常膠束與反膠束示意圖

圖2 反膠束前萃和后萃過程

反膠束法作為新技術，主要涉及兩方面:萃取工藝和萃取過程動力學，通過調控影響因素，可以優化萃取工藝和研究萃取過程動力學，從而使反膠束技術得到更好的應用。

2 反膠束對植物蛋白應用的影響

2.1 植物蛋白和油脂的同時分離

傳統萃取油脂的方法有很多，主要有壓榨法和浸出法，壓榨法存在出油率低、成本高、雜質較多等缺點；浸出法存在有溶劑殘留、易引起蛋白質變性，造成蛋白質資源浪費等缺點。反膠束法在分離蛋白質和油脂時，有機相溶解油脂，“水池”溶解蛋白質等活性物質，該方法存在操作簡單、可連續處理、萃取條件溫和、成本低且不會引起生物活性物質失活等優點，在食品加工行業有著廣闊的應用前景[6]。如表1所示，反膠束法已經實現了多種植物蛋白和其油脂的分離純化實驗，這也證明了該方法應用到工業生產中的可行性。

表1 反膠束法分離不同植物蛋白和油脂的萃取條件和萃取率

2.2 植物蛋白組分和蛋白混合物的分離

反膠束體系分離蛋白混合物和植物蛋白組分是根據不同種類蛋白質的等電點、相對分子質量、氨基酸組成等差別，通過改變前萃和后萃的分配系數，調整體系相關參數(如pH值、離子種類和強度等)，使目標蛋白選擇性的提取到有機相或水相中，從而實現蛋白質混合物分級分離的目的。

植物蛋白中存在多種蛋白組分，這些蛋白組分的結構和功能存在差別，如大豆蛋白主要是由7S、11S球蛋白所構成，而這兩個組分之間具有不同結構和功能，它們的空間構象、溶解性、乳化性等都存在差別，所以分離植物蛋白組分對研究植物蛋白的功能特性和豐富植物蛋白應用提供了更多可能[6]。如表2所示，反膠束法在分離蛋白混合物和植物蛋白組分上有著較高的提取率，但此類研究較少，應加大此方面研究，為其應用到工業生產上提供更多理論基礎。

表2 反膠束分離不同蛋白混合物最優萃取條件

3 反膠束對植物蛋白結構的影響

蛋白質的結構和功能特性密切相關，如牛胰核糖核酸酶的變性與復性實驗就是蛋白質結構與功能關系有力的實證[11]，而萃取方法和條件的不同也會對蛋白質的結構造成不同程度的影響，從而影響蛋白質的功能。在反膠束提取植物蛋白時，影響反膠束提取的因素有很多，如表面活性劑的種類、離子的強度以及pH等，當離子強度過高時則會導致蛋白質變性失活，從而對蛋白質的功能特性造成影響[12]。因此，研究反膠束提取法對植物蛋白結構的影響，也為植物蛋白功能特性的開發奠定了基礎。

3.1 植物蛋白的分子質量

相關文獻表明，與反膠束法制備的大豆分離蛋白相比，堿提酸沉法制得的蛋白α亞基具有部分解離現象，條帶削弱分解造成分子質量變小，表明反膠束提取法對大豆蛋白分子的結構影響較小[13]。最新研究成果得出，反膠束法制備的榛仁蛋白亞基分子質量集中在16～73 ku范圍之間，分子質量大于75 ku的亞基幾乎沒有;而堿溶酸沉法提取的榛仁蛋白亞基分子質量主要集中在132.21、65.24、50 ku附近，分子質量小于36 ku的亞基幾乎沒有[7]。這可能是與反膠束的尺寸有關，也可能是因為小分子質量蛋白在反膠束中的溶解能力更強。李潤潔等[9]研究發現，不同方法萃取的大豆蛋白質組分存在差異，相比于堿溶酸沉淀法，四種反膠束體系[2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)、AOT-Tween60、十二烷基磺酸鈉(SDS)、SDS-Tween60]制備的大豆蛋白小分子質量亞基較多，主要集中在16～42 ku之間。曾有研究報道，采用超聲波輔助的反膠束體系提取的大豆蛋白大分子質量亞基含量高于單一反膠束體系，這是因為反膠束受“水池”尺寸的影響,提取大分子質量蛋白的能力較差,但加入超聲輔助后, 超聲波利用聲空化能來收集能量,使反膠束中的氣泡在超聲波作用下瞬間瓦解并釋放能量，瞬間產生的熱量為反膠束提取大分子質量蛋白提供了動力支持[14]。

與傳統提取方法相比，反膠束法提取的植物蛋白小分子質量亞基較多，而大分子質量亞基較少，這表明反膠束具有更強提取較小分子質量蛋白的能力，并且提取較大分子質量蛋白的能力較弱，但在加入超聲波輔助后，反膠束體系提取大分子質量植物蛋白的能力有所提高，說明了反膠束法的靈活性。

3.2 氨基酸的組成和含量

氨基酸組成和含量是評判食品營養價值的重要指標，尤其是8種必需氨基酸的含量和組成比，是評判蛋白質營養價值的主要依據[15]。

相關文獻表明，反膠束法提取的大豆7S和11S球蛋白的氨基酸含量顯著高于水相法提取的7S、11S球蛋白，特別是反膠束提取的11S球蛋白必需氨基酸總含量也顯著高于水相法提取的11S球蛋白[16]，表明反膠束法制備的大豆蛋白更好的保留了其營養價值。據報道，反膠萃取法和堿提酸沉淀法提取的核桃蛋白在氨基酸種類上并沒有差別，但反膠束法制備的核桃蛋白氨基酸總量和7種必需氨基酸含量均高于堿溶酸沉法所提取的核桃蛋白[17]。

蛋白質的特定功能是由其特定的構象所決定的，而特定的構象又與其一級結構緊密相關，所以蛋白質在萃取過程中氨基酸組成、含量的變化,可能會引起蛋白功能特性的改變，如鐮刀狀貧血癥產生的原因就是血紅蛋白的β-肽鏈上第6位谷氨酸被纈氨酸所替代[18]。反膠束法提取的植物蛋白與傳統萃取方法相比能夠較大程度地保證其氨基酸組成以及含量，從而保護蛋白的功能特性。

3.3 植物蛋白的二級結構

不同的萃取方法將會對植物蛋白的二級結構產生影響，這種影響可能會引起蛋白功能特性的改變。如表3所示，反膠束法提取的榛仁蛋白不規則構象含量明顯低于堿溶酸沉法，但α-螺旋結構的含量顯著增加，這很有可能是兩種構象之間發生相互轉化[7]，而這種構象比例的改變可能會對植物蛋白的功能特性造成影響。此外可以發現，反膠束法提取的花生蛋白中存在α-螺旋結構，但水相法萃取的花生蛋白中則沒有α-螺旋結構[19]，而α-螺旋是蛋白質中最主要的二級結構形式，是遺傳信息傳遞與表達和肽鏈進一步折疊形成不同構象的分子基礎[20]，這說明反膠束法較大程度保留了花生蛋白的空間結構。

表3 不同方法制備的植物蛋白的二級結構含量

時冬梅等[21]研究發現，水相法提取的11S球蛋白為球狀結構，AOT反膠束提取的11S球蛋白為桿狀或小球狀結構，而SDS反膠束提取的大豆11S球蛋白為光滑的片狀結構，說明不同的反膠束體系可以改變11S球蛋白的微觀結構，而這種變化可能會影響其功能特性。相關文獻表明，AOT反膠束提取的大豆7S和11S球蛋白粒徑間孔隙小于水相法提取的7S和11S球蛋白[16]，這是因為表面活性劑與蛋白質發生了親水相互作用，引起了蛋白質結構的變化，此外反膠束體系的pH 值、溫度等也可能對蛋白質分子孔隙大小產生影響。最新研究表明，反膠束法提取的核桃蛋白球蛋白相比于堿溶酸沉法提取的球蛋白更小，但球體完整、表面光滑，球蛋白空間結構更為緊密、穩定性更好，說明反膠束法對小分子質量蛋白的空間保護能力較強[17]。

反膠束提取法與傳統提取方法相比較大程度的保留了植物蛋白的空間結構，并且對小分子質量蛋白空間結構保護能力更強，但萃取較大分子質量蛋白時會對其進行不同程度的物理改性，而萃取條件的改變也會對蛋白的形狀造成影響。通過控制反膠束法的萃取條件和過程，可為植物蛋白功能特性的改造提供幫助，進而提高植物蛋白的應用范圍。

4 反膠束對植物蛋白功能性的影響

植物蛋白含有豐富的營養價值，取材來源廣泛，因此普遍應用于乳制品、肉制品、面食及飲料等行業的生產加工中。對反膠束法提取的植物蛋白功能特性進行研究，有助于改良植物蛋白的溶解性、持水性、乳化性和發泡性，進而提高植物蛋白的營養價值、消化利用率和保健功效。

4.1 植物蛋白溶解性和持水性

溶解度的大小是展現蛋白質其他功能特征的先決條件，如發泡性、乳化性和凝膠性都取決于蛋白質的起始溶解度，具有較高溶解度并且易于分散的蛋白質可應用于飲品的生產加工。持水性的高低直接決定著產品的風味、質地和組成狀態，它與食品儲藏過程中保鮮以及保型有密不可分的關系。

表4 不同萃取方法制備植物蛋白的溶解性和持水性

從表4可以看出，反膠束法與傳統法相比所提取的植物蛋白溶解性更好，而持水性根據萃取條件的變化也會發生改變。與堿提酸沉法相比，反膠束法所制得的菜籽蛋白和大豆蛋白溶解度更高，但持水性較差[22-23]，這可能是因為反膠束法提取的植物蛋白分子質量較小，而小分子蛋白更易溶解，但蛋白濃度較小，疏水作用也就比較強，這就造成其持水能力弱；但超聲波輔助后的SDS反膠束體系提取的大豆11S球蛋白溶解性和持水性均高于水相法所提取的11S球蛋白[20]，這是由于加入超聲波輔助后，反膠束提取大豆蛋白時增加了11S球蛋白中大分子質量蛋白的萃取率，使得蛋白濃度增加，持水能力提高。此外，不同反膠束體系也會引起植物蛋白溶解性和持水性的變化，例如AOT/SDS復合反膠束體系提取的花生蛋白溶解性和持水性均高于AOT，SDS單一反膠束體系[5]。反膠束提取法的多樣性，為改善植物蛋白的性能提供了更多可能。

4.2 植物蛋白的熱穩定性

食品加工過程中，由于加熱導致的蛋白質變性稱為熱變性。熱變性溫度是影響蛋白質加工的一個重要因素，熱變性會導致蛋白質結構發生改變，進而對其功能特性產生影響。因此研究反膠束法提取的植物蛋白熱穩定性，對食品生產加工的應用具有非常重要的意義。

從表5可以看出，反膠束法制備的植物蛋白變性溫度較高，證明反膠束法對植物蛋白的破壞較小，蛋白質變性較少，熱穩定性較好。植物蛋白變性溫度的提高，不僅可以更好的保護蛋白質空間結構及功能特性，而且降低了植物蛋白在食品生產加工中的難度。但從焓變值可以看出，達到變性溫度時反膠束法萃取的植物蛋白變性所需熱量并不大，更易受到熱破壞。這就要求在實際生產加工中控制溫度的變化，在不達到植物蛋白變性溫度的基礎上進行生產加工。

表5 不同萃取方法制備植物蛋白的變性溫度和變性焓

4.3 植物蛋白的起泡性及泡沫穩定性

蛋清蛋白的起泡性，在蛋糕類食品中的應用十分普遍，但蛋清蛋白中含有較多的膽固醇，并且蛋清蛋白的價格高于植物蛋白[26]。研究植物蛋白的發泡特性和泡沫穩定性為尋找蛋清蛋白的替代品提供了基礎，具有重要的社會和經濟價值。

陳銀鶴等[27]對比了堿溶酸沉淀法和反膠束萃取法制備的菜籽蛋白起泡性和泡沫穩定性，發現反膠束法制備的菜籽蛋白發泡性更好，但泡沫穩定性則不如堿溶酸沉法萃取的菜籽蛋白。這或許是因為反膠束提取小分子質量蛋白的能力更強，并且小分子質量蛋白更容易在空氣/水界面吸附和擴散，降低了界面張力，泡沫更容易形成；反膠束提取的蛋白雖吸附在界面上的速度更快，但其肽鏈并不能快速伸展，并且產生互相作用進而形成保護結構，因此泡沫穩定性較差。最新研究成果得出，反膠束法提取的核桃蛋白起泡性及泡沫穩定性，隨著核桃蛋白濃度增加逐漸提高[28]。曾有研究報道，反膠束所提取的脫脂小麥胚芽蛋白其起泡性及泡沫穩定性都明顯高于堿溶酸沉淀法提取的蛋白，并且該蛋白的起泡性及泡沫穩定性均高于蛋清標準，這也使其有望成為雞蛋蛋白的廉價替代品[29]。

反膠束法提取的植物蛋白具有更好的起泡性，但泡沫穩定性不同植物蛋白有所差別。通過改變植物蛋白的萃取條件或方法，可以影響植物蛋白的起泡性及其泡沫穩定性。研究不同植物蛋白萃取過程中影響其起泡性及穩定性的因素，探索更多起泡性、泡沫穩定性優良的植物蛋白，可為植物蛋白在蛋糕類食物中的運用提供新思路。

4.4 植物蛋白的乳化性及乳化穩定性

乳化性是蛋白質主要的功能特性之一，乳狀液可以改變食品的口感，掩蓋不期望有的風味，許多食物都是乳狀液品，如酸奶、沙拉醬、奶油等。因此，提高蛋白質的乳化性能和乳化穩定性以及應用范圍一直是食品科學領域的研究熱點，而蛋白質的兩種乳化特性與其氨基酸組成、電荷分布、分子大小以及構象有關。

李其昌等[7]研究發現，反膠束法提取的榛仁蛋白乳化性和乳化穩定性較堿提酸沉法更好。總體的趨勢是，當pH值小于5時，兩種乳化性質隨著酸度增大而提高，當pH值大于5時，隨著堿性增強，兩種乳化性質提高。堿提酸沉法萃取的榛仁蛋白乳化性及其穩定性較差，可能是因為堿提酸沉法萃取的蛋白質變性程度更高、溶解度更小。相關文獻表明，反膠束法提取核桃蛋白的乳化性及穩定性在靠近等電點時出現最小值，而遠離等電點時隨之增強；并且隨著核桃蛋白濃度的增加其乳化性及穩定性提高，這可能是因為隨著蛋白質量濃度的增加，界面膜的厚度和強度也逐漸增大[30]。

由此可見，植物蛋白的兩種乳化性能均與其溶解性有關，等電點的溶解度最小，直接導致乳化性及穩定性的下降，而反膠束提取的植物蛋白溶解性較好，所以其乳化性及穩定性均勝于傳統提取方法。

5 結束語

反膠束提取技術在分離提純植物蛋白方面的優勢顯而易見，但反膠束技術分離生物制品還面臨很多亟待解決的難題，如蛋白在分離過程中結構與功能特性關系變化規律尚不清楚、表面活性劑和有機溶劑在蛋白中殘留的安全性問題、混合反膠束體系與新型生物表面活性劑的研發及應用問題、優化提取率及控制生產成本的問題等[2]。這些問題的解決，將有助于反膠束提取技術在食品加工行業中的運用。基于反膠束提取技術在將來發展和應用中的優勢，反膠束提取的研究應著力于實現工業化生產，著重研發新的反膠束萃取體系，使目標產物質量、產率沿著最優化方向發展。隨著反膠束提取技術的持續發展，其研究及應用將顯現巨大的潛在價值。