自體卵巢組織冷凍在女性腫瘤患者生育力保存中的應用

馬聰，鄒慧娟，王建業，吳歡，胡晶晶，王影，吳榮，周平，許孝鳳*

(1. 安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科，合肥 230032；2. 國家衛生健康委配子及生殖道異常研究重點實驗室，合肥 230032；3. 出生人口健康教育部重點實驗室，合肥 230032；4.生殖健康與遺傳安徽省重點實驗室，合肥 230032；5.安徽省生命資源保存與人工器官工程技術研究中心(安徽醫科大學)，合肥 230032)

腫瘤是危害人類健康的主要公共衛生問題，也是中國居民死亡的第二大原因。隨著癌癥篩查網絡的逐漸完善以及早期診斷技術、治療水平的提高，1991年至2016年全球癌癥死亡率下降了27%[1]。癌癥管理的改善和存活時間的延長，使腫瘤患者對保存生育能力的需求不斷提高[2]。

在每年新確診的女性腫瘤患者中，大約有5%為育齡期女性。50%～80%的患者會因放療、化療導致卵巢功能不全，出現圍絕經期癥狀。嚴重者會出現卵巢組織的纖維化，卵泡數的減少甚至消失，引起卵巢功能衰竭，喪失生育能力[3]。腫瘤治療技術的提高延長了患者的生命，而生育力保存技術的發展則改善了患者的生活質量。

生育力保存方案與患者年齡、癌癥類型、治療方式、生育伴侶、可用于生育保存的時間和卵巢代謝等因素有關。女性腫瘤患者的生育力保存多采用低溫冷凍保存的方法，主要技術有3種：胚胎冷凍，卵母細胞冷凍和卵巢組織冷凍[4]。目前，胚胎冷凍和成熟卵母細胞冷凍是美國生殖醫學學會認可的保存生育能力的方法[5]。

胚胎冷凍在國內外各大生殖中心的應用較為普遍，其獲得的效果令人鼓舞，但并不適于青春期前或者沒有配偶的女性。卵母細胞冷凍技術對惡性腫瘤患者來說有時間的局限性，促排卵獲取成熟的卵母細胞是長周期過程，而腫瘤患者有可能在促排卵過程中延誤了治療腫瘤的最佳時機。而且胚胎冷凍和卵母細胞冷凍技術都不能完全恢復女性生殖內分泌功能，對提高患者生活質量效果有限，導致患者會過早出現圍絕經期癥狀。安徽醫科大學第一附屬醫院于2016年在省內率先開展生育力保存，目前生育力保存庫中已有14例患者。本研究對庫中14例患者的卵母細胞、胚胎及卵巢組織冷凍情況進行總結分析，探討不同生育力保存方法的適應癥。

一、資料和方法

1.研究對象：本研究回顧性分析2017年12月至2019年9月，在安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心生育力保存庫進行生育力保存14例患者的資料。根據患者婚育情況及個人意愿，制定相應方案，并簽署相關知情同意書。

2.卵巢組織獲取及處理：適應證為年齡≤40歲、放化療術前，卵巢儲備功能正常，且有意愿進行生育力保存的女性腫瘤患者。完善相關檢查，排除手術禁忌，不予促排卵等處理，行腹腔鏡下雙側卵巢楔形切除術。將獲取的卵巢組織放入4℃生理鹽水培養皿中，立即轉運至胚胎培養室。Ova Rinse液(KITAZATO，日本)洗凈組織后，并在含Ova Rinse液的培養皿中用直頭剪刀沿卵巢組織赤道面剪開，用彎頭剪頭及鑷子小心分離皮質、髓質，分離出的皮質厚度大約為1 mm，用手術刀將皮質切成0.5 cm×0.5 cm至1 cm×1 cm大小。

3.卵巢組織平衡及凍存：本培養室采用日本KITAZATO公司卵巢組織平衡試劑盒(Ova Cryo Kit Type M VT301S)，含有Cryo1(20 ml)、Cryo2(20 ml)和Cryo3(20 ml)。將平衡液提前復溫至室溫(25℃～27℃)，并倒入分別貼有Cryo1、Cryo2、Cryo3標簽的相應培養皿(直徑 60 mm)中；將切好的卵巢皮質用無菌紗布拭干表面液體，浸入Cryo1液中靜置5 min；用鑷子將卵巢皮質從Cryo1中取出，在培養皿邊緣瀝凈表面液體，再浸入Cryo2液中靜置5 min；同上操作，將卵巢皮質浸入Cryo3液中靜置15 min。多塊卵巢皮質可同時進行以上操作；將沉入皿底的卵巢皮質取出，拭干后平貼于針刺式載體表面(KITAZATO，日本)，并使其表面積最大化；將載桿快速放入液氮中，緩慢搖動除去表面空氣，觀察組織變為玻璃化樣。登記患者信息，記錄凍存管數及位置。

4.卵母細胞收集：在分離卵巢皮質、髓質的過程中，未成熟的卵母細胞會掉落至Ova Rinse液中。將Ova Rinse液經100 μm細胞篩過濾，在解剖顯微鏡下尋找卵丘復合物(oocyte-cumulus complex，OCCs)。將收集到的卵丘復合物置入取卵沖洗液中充分洗滌，移入卵母細胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養皿。分別體外培養 24 h、48 h后觀察，按卵母細胞第一極體排出情況收集成熟卵母細胞。

5.卵母細胞冷凍：適應證為未婚、年齡≤40歲、放化療術前、卵巢儲備功能正常且有意愿進行生育力保存患者。將經過IVM培養成熟的第2次減數分裂中期(MII)的卵母細胞進行玻璃化冷凍，冷凍試劑采用日本KITAZATO公司標準化試劑盒(VT101)。記錄凍存枚數及凍存位置。

6.胚胎冷凍：適應證為已婚、年齡≤40歲、放化療術前、卵巢儲備功能正常，且有意愿進行生育力保存患者。將收集到未成熟卵母細胞經IVM技術于體外成熟后，采用卵胞漿內單精子注射(ICSI)方式授精。將受精正常的胚胎放入Cleavage培養液中(Cook，美國)，于培養箱中培養至第3天(卵裂期)或第5～6 天(囊胚期)，采用日本KITAZATO公司標準化試劑盒(VT101)，進行卵裂期和囊胚期胚胎玻璃化冷凍。記錄凍存胚胎數及凍存位置。

二、結果

1.患者基本信息：14例患者以乳腺癌、卵巢交界性腫瘤為主要病種。乳腺癌患者占比57.1%(8/14)，平均年齡為(26.88±1.89)歲；卵巢交界性腫瘤占比28.7%(4/14)，平均年齡為(27.75±2.06)歲；結腸癌、子宮內膜癌各1例，各占比7.1%(1/14)(表1)。

表1 患者基本信息[(-±s)，%]

2.患者生育力保存方案的選擇：本生殖中心生育力保存庫于2016年建立。截止至2019年9月，已有14例女性腫瘤患者進行生育力保存，平均年齡為(27.35±1.52)歲，其中已婚7人、未婚7人。對于已婚患者，本中心推薦卵巢組織玻璃化冷凍+胚胎冷凍方案，71.4%(5/7)的患者采用本方案進行生育力保存，其余3例因未獲卵或個人意愿，僅進行了卵巢組織玻璃化冷凍；對于未婚患者，本中心推薦卵巢組織玻璃化冷凍+卵母細胞冷凍方案，28.7%(2/7)的患者采用本方案進行生育力保存，其余5例因未獲卵或個人意愿，僅進行了卵巢組織玻璃化冷凍(表2)。

7例患者于體外獲取未成熟卵母細胞，平均獲卵(10.57±5.97)枚，經體外成熟(IVM)技術于體外培養，IVM平均成熟率為54.05%(40/74)，并根據患者的個人情況進行卵母細胞冷凍或胚胎冷凍。其中，2例患者進行了卵母細胞冷凍，平均凍卵7枚；5例患者進行了胚胎冷凍，平均凍胚(3.2±1.92)枚(表3)。

表2 生育力保存方案的選擇(%)

表3 經IVM成熟卵母細胞及胚胎統計

注：*因未婚無受精卵

討 論

人類在胎兒期大約有295 000個原始卵泡，這些構成了人類卵巢的原始卵泡池，隨著不斷排卵及卵泡閉鎖，卵泡池在絕經期枯竭。腫瘤放、化治療的生殖毒性使卵泡池過度減少，造成卵巢早衰，引起更年期提前[6]。一般認為，電離輻射產生的自由基可破壞DNA分子，如堿基改變、DNA合成抑制或分解增強，引起染色體畸變；破壞蛋白質和酶分子結構，引起細胞凋亡。卵巢損傷的嚴重程度不僅與照射劑量的大小有關，還取決于細胞群中受損細胞的數量或百分率。化療藥物對生殖細胞的毒性機制仍不清楚。化療藥物不一定直接導致原始卵泡凋亡，大部分化療藥物產生的活性代謝產物會與DNA形成交聯，從而抑制DNA的合成和功能，引起細胞凋亡[7]，如：高風險化療藥物——環磷酰胺(烷化劑)可引起DNA鏈內或鏈間發生交聯，干擾細胞分裂；中等風險化療藥物——順鉑主要通過形成DNA鏈內或鏈間加合物，干擾細胞的轉錄和復制[8]。

“生育憂慮”的概念于2005年第一次提出，主要用于年輕的癌癥幸存者。“生育憂慮”是指患者在接受癌癥治療時，由于生殖功能的受損帶來關于性問題、生育問題的憂慮[9]。有報告提出，生育能力的喪失可能比癌癥本身更痛苦[10]。在一項針對癌癥患者的調查中，超過一半的人表示生孩子是他們生命中“最重要的事”，62%的人“最關心”癌癥治療對他們生育能力的影響。此外，癌癥治療后生育孩子，是對患者康復最有力的幫助[11]。

生育力保存技術的發展，給年輕癌癥幸存者帶來生育的希望。卵巢組織冷凍、卵母細胞冷凍及胚胎冷凍是我中心常用的幾種方法。卵巢組織冷凍技術可以把含有大量原始卵泡的卵巢皮質通過玻璃化冷凍保存，是不想接受控制性超促排卵的成年癌癥患者保留生育能力的重要選擇，也是青春期前癌癥患者保留生育能力的唯一選擇[12]。與其他保存方法不同，卵巢組織冷凍不僅保存了原始卵泡，還可以通過解凍移植恢復內分泌功能。許多專家認為，現在已有足夠的證據支持，卵巢組織冷凍保存是一種有效的生育力保存技術，是一種可行的治療方法，而不是僅僅作為一種實驗方法[13]。

胚胎冷凍技術經過30多年的不斷發展，已成為最成熟的輔助生殖技術，是公認的保存生育力的最佳方法[14]。冷凍胚胎移植的相關研究表明，單純冷凍移植組的著床率和持續妊娠率顯著高于新鮮移植組[15]。然而，胚胎的形成需要精子，所以許多年輕的單身女性無法進行胚胎冷凍。此外，胚胎冷凍、保存可能受到其他各種倫理、宗教和社會原因的限制[16]。

卵母細胞冷凍已被證明是一種有效的輔助生殖技術[17]，為未婚女性提供更多選擇，避免倫理問題的發生。世界上多個生殖中心已經報道，在IVF周期中獲得的新鮮卵母細胞和玻璃化冷凍的卵母細胞之間具有相似的妊娠率[18]。美國生殖醫學學會(ASRM)和美國臨床腫瘤學學會(ASCO)已經認可卵母細胞冷凍保存作為“患有癌癥和其他疾病需進行高生殖毒性治療的婦女的生育能力保存策略”[19]。我中心采用卵巢皮質離體取出的未成熟卵母細胞，經未成熟卵母細胞體外成熟(IVM)技術培養至MII期再進行冷凍。卵母細胞復蘇后透明帶硬化的問題，可由ICSI技術解決。該方案可用于無充分時間進行促排卵或者雌激素敏感性疾病(如乳腺癌)的患者。多數專家認為大約40%～80%的未成熟卵母細胞可以成功完成IVM和受精，但未成熟卵母細胞的成熟率仍低于常規獲取的卵母細胞，故將該生育力保存方案放在次優選項[20]。此外，IVM技術的活產率相對常規技術較低[21]，但已有經此方法成功生育的報道[22]。IVM和卵巢組織冷凍保存的結合能為需要緊急保存生育力的年輕患者提供兩種互補的技術。

理想的生育力保存方法是使患者免受腫瘤治療帶來的毒性作用。長期以來，促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-A)被認為是保護卵巢的潛在藥物，在放化療前保護卵巢免受生殖毒性[23]。其作用機制有兩種假說：一種是通過抑制下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)使大部分卵泡處于靜止狀態，減少化療藥物的毒性作用；另一種假說是限制卵巢的血流，減少化療藥物進入卵巢的途徑[8]。GnRH-A能否保護卵巢仍具爭議性。2018年ASCO指南提出，在已證實的生育能力保留方法(胚胎、卵母細胞或卵巢組織冷凍)不可行的情況下，GnRH-A可用于乳腺癌患者減少化療引起的毒性作用。而對于其他類型的腫瘤患者，仍不能使用GnRH-A代替已證實的生育能力保留方法[24]。

各種指導方針建議，在開始癌癥治療之前，應當討論生育力保存的問題，但這方面缺乏實踐。患者的經濟情況、癌癥分型、生存優先及對生育后代的健康擔憂均會影響患者的決定[25]。此外，腫瘤醫生和生殖內分泌醫生之間的缺乏合作是另一方面原因。腫瘤醫生有責任與患者討論預期癌癥治療的生殖風險，生殖內分泌醫生應詳細與患者討論適當的生育保存技術。理想情況下，育齡期的腫瘤患者都應得到規范化的轉診[26]，得到規范化生育力保存治療。