大腸桿菌K88ac-ST1 -LTB 融合蛋白多價卵黃抗體的制備

許崇利， 許崇波， 林一民

（1.吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林132022； 2.重慶醫藥高等?？茖W校 醫學技術學院，重慶401331；3.韶關學院 英東生命科學院，廣東 韶關512005；4.重慶大學附屬腫瘤醫院 腫瘤轉移與個體化診治轉化研究重慶市重點實驗室，重慶400030）

新生仔豬腹瀉是目前規模化養豬生產面臨的主要難題之一，給養豬業帶來了巨大的經濟損失［1-2］.致病性大腸桿菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要病原，其中產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌，它包括黏著素和腸毒素2 種致病因子.黏著素具有良好的免疫原性，主要有K88、987P、K99和F41 等，黏著素使ETEC 黏著于腸黏膜上皮細胞從而使其發生病理性變化最終導致仔豬腹瀉.腸毒素包括ST1、ST2耐熱性腸毒素和LTA、LTB不耐熱性腸毒素，其中ST1沒有免疫原性，LTB無毒性［3-6］.為了更好地解決免疫效果，構建了大腸桿菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗［7-8］.

雖然抗生素作為控制細菌感染的有效藥物廣泛應用于生產中，但抗生素的長期使用引起的耐藥性問題和生產中超量使用抗生素的現象越來越突出，而且控制效果也并不樂觀［9-10］.抗生素替代品的研究成為畜牧業發展的迫切需求.初生仔豬和早期斷奶仔豬自身免疫功能的不成熟以及早期斷奶應激引起的免疫抑制，是造成仔豬對ETEC 敏感性增高、抗病力下降、引發ETEC 感染性腹瀉的主要因素.利用外源抗體為仔豬提供被動免疫，可有效預防和治療腸道ETEC 感染引起的疾病，其中雞卵黃抗體因其化學性質穩定、特異性抗體含量高、安全性好、易規?；a等特點，越來越受到人們的關注，并有潛力開發為一類可替代抗生素的高效生物防治制劑［11-14］.為此，課題組以產蛋雞為生物反應器，采用大腸桿菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗作為抗原，研究開發引起新生仔豬腹瀉的ETEC最主要致病因子（K88ac、ST、LT）的特異性卵黃抗體，為進一步研究開發出一種新型高效、可替代抗生素的防治新生仔豬大腸桿菌性腹瀉的特異性卵黃抗體生物防治制劑打下堅實基礎.

1 材料和方法

1.1 載體和菌株 BL21（DE3）（pETXKSL3）重組菌株由課題組構建，海蘭蛋雞和仔豬購自正大畜禽有限公司.

1.2 試劑 TaKaRa 質粒DNA小量純化試劑盒購自TaKaRa 公司；限制性核酸內切酶NcoI、HindIII和IPTG購自TaKaRa公司；兔抗雞IgG辣根過氧化物酶（HRP）購自北京索萊寶科技有限公司，卡那霉素購自Promega公司.

1.3 重組菌株BL21（DE3）（pETXKSL3）鑒定和Western blot 分析 按照TaKaRa 質粒DNA 小量純化試劑盒說明書提取pETXKSL3 重組質粒，利用限制性核酸內切酶對重組質粒進行鑒定，鑒定正確后送TaKaRa公司進行測序.取5 mL LB培養基，質量濃度30 μg／mL 的Kan，按照質量分數2%接種BL21（DE3）（pETXKSL3）重組菌株，37 ℃ 200 r／min恒溫培養12 ～16 h，轉接至200 mL Kan 質量濃度為30 μg／mL的LB 培養基中37 ℃恒溫培養，當OD600＝0.6 ～0.8 時加入IPTG 誘導劑，其濃度為1 mmol／L，37 ℃誘導4 h后，4 ℃12 000 r／min離心1 min，棄去培養基上清液，所得沉淀即為菌體，20 mL 50 mmol／L Tris·Cl -2 mmol／L EDTA 重新懸浮菌體，12 000 r／min 離心10 min，棄去上清液，10 mL 10 mmol／L Tris·Cl再次懸浮菌體并使用質量濃度為1 mg／mL 溶菌酶破碎菌體，2 mL Triton X-100混勻并于30 ℃條件下水浴15 min.超聲波碎菌儀連續2 個10 s 破碎，12 000 r／min 離心15 min，收集所得沉淀進行SDS -PAGE 電泳分析和Western blotting鑒定［15］.

1.4 卵黃抗體的制備

1.4.1 蛋雞的免疫 將購買的4 月齡海蘭蛋雞隨機分為5 組，按照5∶ 1 的比例將抗原與弗氏完全佐劑均勻混合進行首次免疫，充分乳化后選取胸肌部位進行分點注射，第二次免疫和第三次免疫在首次免疫14 d和28 d后進行，3 次免疫的抗原質量濃度分別為0.4、0.6 和0.8 mg／mL，注射量為每只1 mL／每次，在第二次免疫7 d 后開始收集蛋并以免疫前雞蛋和血清分別作為陰性對照.

1.4.2 卵黃抗體的提取純化 采用水稀釋-鹽析法提取卵黃抗體，首先使用清水去除蛋殼表面的污

物，接著用質量分數0. 5%新潔爾滅浸泡20 ～30 min并晾干，無菌條件下使用蛋黃分離器分離蛋黃與蛋清，9 倍體積的蒸餾水對提取的卵黃液進行稀釋并將pH值調至5.0 ～5.2，置于冰箱4 ℃過夜后收集上清液，滴加飽和（NH4）2SO4至質量分數為60%，6 000 r／min 4 ℃離心15 min 后棄去上清液，收集得到的高免卵黃抗體置于-20 ℃備用.

1.4.3 卵黃抗體的效價檢測 采用間接ELISA對卵黃抗體效價進行檢測，利用包被液將抗原稀釋至質量濃度為3.0 μg／mL，酶標板4 ℃孵育過夜，棄去包被液洗板3 次，加入200 μL／孔封閉液37 ℃孵育2 h，洗板3 次，將卵黃抗體以1∶ 500 的比例進行稀釋，按照100 μL／孔的量加入酶標板37 ℃孵育1 h，洗板3 次后加入兔抗雞辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（1∶ 2 000），按照100 μL／孔的量加入酶標板37 ℃孵育15 min，50 μL／孔加入2 mol／L H2SO4終止反應，酶標儀450 nm波長測定吸光度值并記錄［16］.

1.5 仔豬預防效果試驗 在有仔豬大腸桿菌病患病史的豬場選取3 窩30 頭健康仔豬，分為3 組每組10 頭，1 ～2 組于出生2 h和6 h后口服制備的多價高免卵黃抗體，每次4 mL，對照組3 組未采取任何免疫預防措施，14 d后觀察仔豬腹瀉情況.

1.6 仔豬攻毒保護試驗 將70 頭健康的新生3 日齡仔豬按自然窩次分成7 組，每組10 頭，1 ～5 組為試驗組，50 頭仔豬于出生4 h 和8 h 后分別口服多價高免卵黃抗體4 mL，對照6 ～7 組20 頭不口服高免卵黃抗體.48 h后用8 株大腸桿菌混懸液進行口服攻毒實驗，每頭5 mL，含菌量為1 ×1012CFU／mL，觀察仔豬發病與病死情況并進行病理檢測.

2 結果

2.1 pETXKSL3 重組質粒酶切鑒定 試劑盒快速抽提pETXKSL3 重組質粒，經NcoI／HindIII 雙酶切后進行質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結果表明目的基因830 bp 位于750 ～1 000 bp 之間，序列測序表明pETXKSL3 重組質粒含有目的基因且序列和閱讀框架均正確（圖1）.

2.2 K88ac-ST1-LTB融合蛋白SDS-PAGE分析和Western blot鑒定 BL21（DE3）（pETXKSL3）重組菌株經IPTG誘導劑誘導3 h 后，收集菌體并進行破碎處理，SDS - PAGE 分析表明K88ac - ST1-LTB融合蛋白在BL21（DE3）宿主菌中高效表達，目的蛋白占菌體總蛋白的質量分數為32%. Western blot鑒定證實K88ac -ST1-LTB融合蛋白能夠被ST1單抗、K88ac和LTB抗體所識別（圖2）.

圖1 重組質粒pETXKSL3 酶切鑒定結果Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pETXKSL3 by enzyme digestion

圖2 K88ac-ST1 -LTB融合蛋白的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鑒定Fig. 2 SDS-PAGE analysis（A）and Western blotting identification（B）of the K88ac-ST1 -LTB protein

2.3 卵黃抗體的純化 采用水稀釋-硫酸銨二次沉淀法純化制備的多價高免卵黃抗體，其為澄清透明狀，質量分數15% SDS-PAGE凝膠電泳分析表明在31 ku處有清晰的蛋白質條帶且純度較高（圖3）.

圖3 純化的卵黃抗體SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified egg yolk antibody

2.4 卵黃抗體效價檢測 間接ELISA方法測定多價高免卵黃抗體效價，抗原包被質量濃度為3.0 μg／mL，加入稀釋度為1∶ 2 000 的二抗后，檢測結果顯示水稀釋-硫酸銨二次沉淀法提取的多價高免卵黃抗體效價為1∶ 13 200.

2.5 仔豬預防效果試驗 試驗組20 頭仔豬口服制備的多價高免卵黃抗體14 d后均未發病，預防有效率為100%，對照組10 頭有3 頭發病并死亡.

2.6 仔豬攻毒保護試驗 5 組仔豬進行攻毒保護試驗后，試驗組保護率為96%（48／50）（表1），剖檢后組織學檢查無病理變化，表明口服多價高免卵黃抗體具有很好的免疫預防效果.而對照組20 頭仔豬全部發病并死亡且出現明顯的臨床癥狀，剖檢后組織學檢查發生病理變化.上述結果說明K88ac -ST1-LTB多價卵黃抗體對由ETEC 引起的新生仔豬腹瀉具有很好的預防效果.

表1 仔豬攻毒保護試驗結果Tab. 1 Piglet challenge test results

3 討論

目前為止，針對仔豬黃痢和仔豬白痢的預防與治療措施主要包括接種大腸桿菌多價疫苗以及注射抗生素［17-18］.但抗生素治療由于缺乏有效的監管，往往造成抗生素使用不當，甚至出現抗生素濫用現象，而且長期使用抗生素也會引起耐藥性問題，不斷出現大腸桿菌耐藥菌株從而影響治療效果.另外，肉制品中超標的抗生素也會危害身體健康［19-20］.國內對于仔豬腹瀉的免疫預防雖然取得了較好的效果，但商業化的疫苗往往只針對ETEC菌毛，尚未有針對腸毒素的疫苗且只產生體液免疫，而且即使疫苗預防在體內產生高水平的抗體，但對于已經侵入腸道內的致病菌仍不能抑制其復制釋放毒素.另外，疫苗預防會有不同程度的副作用，甚至會產生炎癥反應從而影響免疫效果.因此，探索研發替代抗生素更有效的預防和治療措施變得尤為重要.

迄今為止對于仔豬腹瀉治療主要采用抗生素，但抗生素僅對細菌起到抗菌效果，對于腸毒素作用效果并不顯著，而且大腸桿菌極易產生耐藥性，長時間使用抗生素會導致濫用現象并產生耐藥菌株.另外，抗生素在殺菌同時也會抑制腸道內正常的益生菌從而導致腸道內微生物菌群失衡，干擾消化吸收功能.卵黃抗體是從免疫禽蛋中提取出來的針對特定抗原的抗體，卵黃抗體因其穩定性好、耐酸堿、耐高溫、易于制備及純化等獨有的特點從而得到很好的開發和應用.近年來，研究人員利用卵黃抗體治療仔豬腹瀉方面進行了大量研究，研究表明卵黃抗體能有效防制仔豬腹瀉且不會產生耐藥性，有望成為新型可替代抗生素的高效生物防治制劑.課題組以產蛋雞為生物反應器，采用大腸桿菌K88ac -ST1-LTB基因工程疫苗作為抗原，研究開發引起新生仔豬腹瀉的ETEC最主要致病因子（K88ac、ST、LT）的特異性卵黃抗體，為進一步研究開發出一種新型高效、可替代抗生素的防治新生仔豬大腸桿菌性腹瀉的特異性卵黃抗體生物防治制劑打下堅實基礎.