基于中醫代謝組學特征探討參苓白術丸聯合黃芪顆粒干預肺纖維化的作用機制

劉洋， 鄭彩霞， 韓金花， 孫豐云， 于盼， 張念志

（1.淮北市中醫醫院，安徽淮北 235000；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽合肥 230031）

肺纖維化是一類以炎癥細胞浸潤、成纖維細胞沉積并伴有肺組織結構破壞為特征的彌漫性病變，既往多從信號通路、炎癥因子等角度對其進行了探討[1]。基于中醫整體觀念的益氣健脾療法的機制研究已經廣泛地運用到防治肺纖維化這一慢性疾病當中，但中醫藥的研究需要多視角、系統地、綜合地進行機制研究。代謝組學研究方法包含機體生物代謝的整體信息，與中醫學的“整體觀”和“生態醫學觀”非常吻合，為中醫“證候”本質的研究拓展了新思路，是中醫證候研究的重要方法[2-3]。為此，我們采用代謝組學技術，將肺纖維化肺脾氣虛證患者與健康人群對比，尋找肺脾氣虛證的潛在證候標志物，并觀察參苓白術丸聯合黃芪顆粒治療肺纖維化肺脾氣虛證患者血漿中潛在證候標志代謝物的變化，推測其體內生化過程和狀態的變化，揭示參苓白術丸聯合黃芪顆粒治療肺纖維化肺脾氣虛證的作用機制，利用代謝物的終端性信息，為尋找藥物作用的靶點或受體提供臨床指導。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018 年5 月至2019 年1 月在淮北市中醫醫院門診就診的23 例肺纖維化肺脾氣虛證患者作為肺纖維化組，另選取20 例健康體檢者作為對照組，所有受試者均自愿簽署知情同意書。

1.2 診斷標準西醫診斷標準:參照2011年特發性肺纖維化（IPF）診斷和治療循證新指南[4]。中醫證候標準:參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]和《中醫內科學》[6]中的有關內容，中醫證型為肺脾氣虛型。主要癥狀:喘息，咳嗽，胸悶氣短，畏風寒，納差乏力，易汗出或自汗，舌淡苔白，脈浮。

1.3 納入標準①符合上述疾病診斷標準及中醫證候診斷標準，且1 個月內未使用其他藥物治療；②年齡在45～65 歲；③處于肺纖維化穩定期；④自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1. 4 排除標準①有明確職業病史（塵肺、矽肺）、藥物史（胺碘酮）等原因引起的肺間質性疾病患者；②有嚴重心肝腎功能損害的患者；③有其他嚴重疾病的患者；④依從性差，未按規定接受治療，從而影響療效判定的患者。

1.5 治療方法

1.5.1 治療組 給予參苓白術丸聯合黃芪顆粒治療。（1）參苓白術丸（主要成分:人參、炒白術、陳皮、茯苓、山藥、砂仁、桔梗等；由河南宛西制藥有限公司生產， 批準文號: 國藥準字Z8121003），口服，每次4 丸，每日3 次。（2）黃芪顆粒（貴州漢方藥業股份有限公司生產，批準文號:國藥準字Z19993254），沖服，每次2 袋（每袋相當于中藥飲片黃芪15 g），每日2 次，2 個月為1 個療程。

1.5.2 對照組 不給予任何干預治療。

1.6 觀察指標與標本檢測

1.6.1 中醫證候評分 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]，結合臨床實際制定。主要包括喘息、咳嗽、自汗、乏力等4 項，根據程度分為無、輕、中、重4級，分別計為0、1、2、3分。

1.6.2 標本檢測方法

1.6.2.1 標本采集 對照組抽取靜脈血4 mL，肺纖維化組于治療前和治療后各抽取靜脈血4 mL，2 組血液樣本以3 000 r/min的速度離心15 min（溫度小于4 ℃），取上清液留存于-70℃冰箱待用。

1. 6. 2. 2 標本制備 檢測前將所有血漿樣本4℃解融，乙腈、蒸餾水預冷8 h。乙腈/血漿樣本為3∶1比例（3 000 μL/1 000 μL）進行蛋白沉淀，渦旋混勻；以15 000 r/min 離心10 min，取上清液，與乙腈、蒸餾水按1∶1∶3稀釋，移入液相瓶中待測。

1.6.2.3 樣本質量控制 各組樣本4 ℃解融，渦旋混勻，分別吸取100 μL 血清，再次渦旋混勻后分裝于EP管中。其余處理同本方法。

1.6.2.4 液相色譜—質譜聯用（HPLC-MS）檢測 在安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥藥理實驗室采用HPLC-MS 和AB SCIEX Q-Triple 4500 System檢測分析。色譜柱:Shim-pakISC-07/S1504Li（150 mm × 4.0 mm）；流速:0.5 mL/min；進樣量:10 μL；柱溫:40 ℃；流動相:A:將蒸餾水和乙腈按照19∶1 的比例配置，并加入600 μL 乙酸溶液和5 mL 乙酸銨。B:將乙腈和蒸餾水按照19∶1 的比例配置，并加入600 μL 乙酸溶液和5 mL 乙酸銨。梯度洗脫條件如下:先加入2%乙腈，20 min內增加至95%乙腈，在2 min 內降至3%并維持5 min，后運行時間設為5 min；流速為0.5 mL/min；樣本體積為5 μL。

1. 6. 2. 5 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI）正離子模式檢測，質譜檢測范圍:質荷比（m/z）100 ～1 200 Da；CUR:40.0 psi；CAD High Ion Spray VoHage: 5 000 V；DP:80 V；EP:20 V；CE:10 eV；TEM:600 ℃。

1.7 統計方法及數據處理

1.7.1 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的統計處理。計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t 檢驗；計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

1.7.2 數據處理 （1）本研究采用美國AB 公司的markerview 1.2.1 代謝組學分析軟件對歸一化的數據進行自動建模分析，輸出形式為載荷圖[7]。載荷圖中的每一個點表示一個代謝區域，處于病理狀態的樣本在散點分布處于相似的位置；載荷圖上每一個點表示代謝物的相關信息，距離原點越遠，表示其病理生理狀態差距越大，對不同組間的分離貢獻亦越大[8]。（2）利用SIMCA V14.1 代謝組學分析軟件，對數據進行主成分分析（PCA）正交偏最小二乘法—判別分析（OPLS-DA），最大化顯示模型與主成分相關差異。利用OPLS-DA 模型變量因子（VIP＞1，t 檢驗，P＜0.05）的條件進行質荷比篩選和尋找差異性代謝物，通過檢索數據庫（http://metlin.scripps.edu/、www.hmdb.ca/metabolites、KEGG、LIPID）定性可能的差異代謝物，推測代謝物種類，對差異性代謝物進行分析，從而找到與代謝差異物相關性最高的通路所在。

2 結果

2.1 肺纖維化組與對照組的基線資料比較肺纖維化組23 例受試者中，男14 例，女9 例；年齡56～65 歲，平均（58.06±6.82）歲。對照組20 例受試者中，男15 例，女5 例；年齡51～63 歲，平均（53.06±7.82）歲。2 組受試者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 肺纖維化組患者治療前后各項中醫證候評分比較表1 結果顯示:治療2 個月后，肺纖維化組患者喘息、咳嗽、自汗、 乏力評分均較治療前明顯改善，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

表1 肺纖維化組患者治療前后各項中醫證候評分比較Table 1 Comparison of TCM syndrome scores in the case group before and after treatment（±s，s/分）

表1 肺纖維化組患者治療前后各項中醫證候評分比較Table 1 Comparison of TCM syndrome scores in the case group before and after treatment（±s，s/分）

①P＜0.01，與治療前比較

時間治療前治療后N/例23 23喘息2.95±1.34 0.11±0.03①咳嗽1.95±0.61 0.37±0.22①自汗2.05±0.52 0.83±0.41①乏力2.05±0.66 0.71±0.57①

2.3 肺纖維化組患者治療前后和對照組的血漿代謝物PCA 圖PCA 圖能反映各組樣本代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。分析模型參數為R2X，其值大于0.4 表示可靠。2 組共計獲得8 個主要成分，共計R2X=0.652。從圖1 可看出，肺纖維化組與對照組代謝物分別處于不同區域，有顯著性差異。

圖1 肺纖維化組治療前后和對照組的血漿代謝物PCA圖Figure 1 PCA results for the plasma differential metabolites in the case group before and after treatment and in the control group

2.4 肺纖維化組患者治療前后和對照組的血漿代謝物OPLS載荷圖采用OPLS對2組樣本獲得差異性代謝物信息，模型參數:R2X 值為0.473，R2Y值為0.983、Q2值為0.876，提示該模型穩定且可信度高。圖2 載荷圖中的圓點（X）代表了所有差異性代謝物，載荷圖左右兩端的物質是潛在的差異標志物。距離藍色三角（Y）越近，其變異量也越大，而這些大的變異量在樣本分類中起決定性的作用。治療后肺纖維化組代謝物同對照組融合交織，與治療前相比差異顯著，結果見圖3。

圖2 肺纖維化組治療前和對照組的血漿代謝物OPLS載荷圖Figure 2 OPLS load chart for the plasma differential metabolites in the case group before treatment and in the control group

圖3 肺纖維化組治療后和對照組的血漿代謝物OPLS載荷圖Figure 3 OPLS load chart for the plasma differential metabolites in the case group after treatment and in the control group

2.5 潛在證候標志代謝物治療前后變化趨勢結合重要變量因子VIP值，借助（KEGG、LIPID）等相關數據庫，經t 檢驗選出差異變量，通過對肺纖維化組治療前后差異性代謝物，推測出在正離子模式下，磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、基質金屬蛋白酶1、白三烯4、脂氧素15-epi-LXB4、15-羥基二十碳四烯酸6種物質為肺纖維化組干預后的差異性代謝物。表2 顯示肺纖維化組治療后磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4 等成分較治療前下降，趨向于健康對照組水平。

表2 潛在證候標志代謝物變化趨勢Table 2 Tendency of the changes in the potential syndrome marker metabolites

2.6 肺纖維化組治療前后與對照組血漿差異性代謝物的代謝通路如圖4所示，每一個氣泡代表一個代謝通路，氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小，氣泡越大影響因子越大；氣泡所在的縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P 值（-log10P-value），顏色越深，P 值越小，富集程度越顯著。如圖4、5 所示，肺纖維化組治療前所涉及的主要異常代謝通路為神經酰胺酶代謝、磷脂酶代謝、谷胱甘肽代謝、α-亞麻酸代謝、鯊烯代謝、二十四烷酸代謝；治療后的代謝通路為神經酰胺酶代謝、磷脂酶代謝。

圖4 肺纖維化組治療前與對照組血漿差異性代謝物的代謝通路圖Figure 4 The main metabolic pathways of plasma differential metabolites in the case group before treatment and in the control group

圖5 肺纖維化組治療后與對照組血漿差異性代謝物的代謝通路圖Figure 5 The main metabolic pathways of plasma differential metabolites in the case group after treatment and in the control group

3 討論

肺纖維化治療缺乏特效藥物，目前大多采用糖皮質激素或聯合細胞毒藥物治療，存在一定的不良反應，而中醫藥以其多成分、多靶點的作用特點，在提高療效、改善生活質量、減輕毒副作用上有較好療效。肺纖維化屬中醫“肺痿”范疇，是由于肺氣虛弱、氣不布津而導致的以咳吐濁唾涎沫為主癥的一類疾病，研究[9]證實其基本證型以肺氣虛證為主，治療也多以益氣為主，再結合辨證給予化痰健脾祛濕為法。參苓白術丸出自宋代《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾、祛濕之功效，為“培土生金”治法的常用方劑；而黃芪具有補肺氣之功效。現代藥理研究表明，方中的主要成分人參皂苷具抗疲勞、增強機體免疫功能作用[10]；而黃芪顆粒中的黃芪多糖能升高白細胞，提高網狀內皮系統功能，激活T 細胞、自然殺傷（NK）細胞等免疫細胞活性[11]。本研究結果顯示，肺纖維化組患者治療后的各項中醫證候評分均較治療前明顯改善，差異均有統計學意義（P＜0.01），表明參苓白術丸聯合黃芪顆粒能顯著改善肺纖維化患者肺脾氣虛證的臨床癥狀。

中醫方劑對應的是證候或病，發現證候/病的生物標志物，建立臨床療效的生物評價體系是評價方劑臨床療效進而發現中藥藥效物質基礎的基本前提[12]。中醫方證代謝組學以中醫證候/病的本質研究為起點，通過方劑內顯效成分和相關代謝標志物的關聯性，從而為深入了解疾病的發病過程提供理論依據，為疾病診斷及評價藥物療效提供指導，是體現中藥復方配伍的有效性方案[13]。張淼等[14]研究發現人類免疫缺陷病毒感染導致的獲得性免疫缺陷綜合征（HIV/AIDS）肺脾氣虛證患者存在脂代謝異常表現，血清中載脂蛋白（ApoA2）、甘油三酯（TG）升高，ApoB、人鋅α2 糖蛋白（AZGP1）降低，血脂表現異常，證實ApoA2、ApoB、AZGP1、TG 為HIV/AIDS 肺脾氣虛證的潛在生物學標志物。以上研究證實差異代謝物可反映病理所對應的代謝異常物質和功能的改變，并能確定其代謝通路的異常，表明代謝組學技術與傳統中醫學理論相結合有廣闊的應用前景。

本研究顯示，肺纖維化組（PCA 圖）在治療后向健康對照組融合回歸，2 組代謝物質類似，表明參苓白術丸聯合黃芪顆粒治療肺纖維化肺脾氣虛證有顯著臨床療效。肺纖維化組治療后磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4等成分較治療前下降，趨向于對照組水平。說明參苓白術丸聯合黃芪顆粒干預治療后，患者的病情得到一定程度恢復，反映了其作為潛在證候標志代謝物的可靠性，進而推測出參苓白術丸聯合黃芪顆粒治療可通過下調磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4 等代謝物質而發揮治療作用，其中對脂類代謝物質（磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4）改善顯著，表明脂類代謝異常與肺纖維化的發生發展有密切聯系，因此結合相關的脂類變化，找到異常的代謝通路，識別脂類生物標志物，對肺纖維化的病因及治療提供指導以及提供新的藥物治療靶點，從而進一步提高臨床療效。肺纖維化組治療后的代謝通路為神經酰胺酶代謝、磷脂酶代謝為代表的鞘磷脂類代謝為主，表明參苓白術丸聯合黃芪顆粒通過神經酰胺酶、磷脂酶通路參與改善肺纖維化發病過程，神經酰胺酶、磷脂酶類代謝通路的差異性是肺纖維化炎癥等癥狀存在的基礎，進一步證實了以神經酰胺酶、磷脂酶為代表的鞘磷脂類代謝通路的差異性是參與肺纖維化疾病發展過程中的主要通路所在。大量研究[15]表明，脂類代謝異常與呼吸系統疾病的發生發展有著密切聯系，鞘磷脂主要位于細胞膜和脂蛋白中，主要參與細胞信號轉導、增殖、凋亡等過程。有證據[16-17]表明，鞘磷脂類信號通路在肺纖維化的發病中起著重要作用，鞘磷脂參與肺纖維化疾病主要是受到神經酰胺水平的調控，機體在氧化應激的情況下誘導鞘磷脂酶活化及產生神經酰胺從而導致疾病的發生，鞘磷脂酶抑制劑可能成為一類新的藥物在防治肺纖維化中發揮重要作用。因此，基于中醫方證對應療效的專屬性，利用中醫證候代謝組學，識別脂類生物標志物，發現異常的代謝通路，建立方劑藥效生物評價體系，能夠深入揭示肺纖維化的發病機制和提供新的藥物治療靶點，進而指導臨床用藥。