siRNA干擾Annexin A7對宮頸癌細胞株Ki67和P16的影響

周星 陳雪 崔磊 孫吉瑞 張丙信 李藝萱 張金庫

[摘要] 目的 探討宮頸癌細胞株中膜聯蛋白A7（Annexin A7）表達抑制后對Ki67和P16的影響。 方法 細胞培養后分成siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組進行小干擾RNA（siRNA）干擾，抑制宮頸癌細胞系Hela細胞Annexin A7的表達，蛋白印跡法鑒定其干擾效率后，應用激光共聚焦免疫熒光法檢測Annexin A7表達抑制后對Hela細胞Ki67和P16表達的影響。 結果 干擾組Annexin A7的表達量與陰性對照組和空白對照組比較明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）;與陰性對照和空白對照組比較，Ki67陽性產物在siRNA干擾組明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05）;siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組P16陽性產物比較差異無統計學意義（P > 0.05）。結論 Annexin A7可能參與了宮頸癌細胞增殖功能的上調作用。

[關鍵詞] 膜聯蛋白A7;Ki67;P16;宮頸癌

[中圖分類號] R737.33 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0012-03

Effect of siRNA interference Annexin A7 on cervical cancer cell lines Ki67 and P16

ZHOU Xing1 ? CHEN Xue1 ? CUI Lei2 ? SUN Jirui1 ? ZHANG Bingxin1 ? LI Yixuan1 ? ZHANG Jinku1▲

1.Department of Pathology， Baoding N0.1 Central Hospital， Hebei Province， Baoding ? 071000， China; 2.Department of Cardiovascular Medicine， the N0.2 Hospital of Baoding， Hebei Province， Baoding ? ?071000， China

[Abstract] Objective To study the effect of Annexin A7 expression inhibition on Ki67 and P16 of Hela cells. Methods After cell culture， the cells were divided into the siRNA interference group， the negative control group and the blank control group for small interfering RNA （siRNA） interference to inhibit the expression of Annexin A7 in Hela cells of cervical cancer cell line. After the interference efficiency was identified by Western blot， the effect of the inhibition of Annexin A7 on the expression of Ki67 and P16 in Hela cells was detected by laser confocal immunofluorescence assay. Results Annexin A7 expression in the siRNA intervention group was significantly lower than that in the negative control group and the blank control group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the negative control group and the blank control group， Ki67 positive products were significantly reduced in the siRNA interference group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no statistically significant difference in P16 positive products among the siRNA interference group， the negative control group and the blank control group （P > 0.05）. Conclusion Annexin A7 may get involved in upregulated cell proliferation of squamous cell carcinoma of the cervix.

[Key words] Annexin A7; Ki67; P16; Cervical carcinoma

宮頸癌以鱗狀細胞癌最為常見，其發生率位居女性惡性腫瘤第二位，尤以發展中國家更為常見，嚴重危害了女性的健康及生命[1]。研究發現人乳頭瘤病毒（HPV）感染是導致宮頸癌發生的主要原因[2-3]，并引起Ki67和P16表達上調，因此，近年來Ki67和P16免疫標記已經越來越多地應用于宮頸癌的早期診斷[4-6]。本課題組報道過膜聯蛋白A7（Annexin A7）在人子宮頸鱗癌組織中表達上調[7-8]。本研究使用小干擾RNA（siRNA）干擾技術抑制Annexin A7在宮頸癌細胞系Hela細胞中的表達，在免疫熒光染色后，應用激光共聚焦顯微鏡觀察Ki67和P16的表達變化，探討Annexin A7與兩者的關系，為研究人宮頸鱗癌的發生發展機制及臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑及細胞株

共聚焦激光顯微鏡（Zeiss，LSM800）;化學發光及熒光影像分析儀（日本富士公司，FUJIFILM LAS4000）;Ki67和P16免疫熒光試劑盒購于上海生物工程股份有限公司（生產批號：E607238、ESK6322）;Annexin A7 siRNA試劑盒（美國Invitrogen公司產品，LipofectamineTM 2000）;宮頸癌細胞株Hela細胞來自河北醫科大學醫學遺傳學教研室。

1.2 siRNA干擾效率的測定

將Hela細胞培養于25 mL的培養瓶中，DMEM培養基，10%胎牛血清，置入培養箱，37℃、5%CO2。轉染前1 d種植細胞于6孔板中，密度為（1～2）×105/孔;250 μmol/L DMEM培養基中加30 pmol siRNA，250 μmol/L DMEM培養基中加5 μL Lipofectamine轉染試劑，兩者混合，輕輕混勻，室溫靜置約20 min;將細胞分成3組：siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組;吸掉6孔板中的DMEM培養基，無血清培養基輕柔清洗2次，每孔加DMEM培養基2 mL，混合物加至培養孔中，陰性對照組加入StealthRNAi Negative control;空白對照組僅加DMEM培養基，輕柔混勻;6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養基，48 h后收集細胞免疫印跡（Western blot）鑒定siRNA抑制效果。

1.3 Ki67和P16免疫熒光檢測

在6孔細胞培養板底放入無菌蓋玻片，干擾48 h后倒掉DMEM培養基，加入4%多聚甲醛固定40 min，0.25%的Triton X-100透膜8 min。封閉1 h后，加Ki67或P16熒光一抗（Ki67，1∶200;P16，1∶300），4°C濕盒中孵育過夜，室溫孵育1 h后，加酶標二抗（1∶200），DAPI復染后激光共聚焦顯微鏡觀察，LSM510軟件分析。Ki67和P16免疫陽性產物表達于細胞核。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNAR干擾效率的測定

Western blot結果顯示：宮頸癌細胞株Hela細胞中Annexin A7在siRNA干擾組明顯受到了抑制，其表達降低（圖1）。siRNA干擾組Annexin A7表達量低于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），而陰性對照組和空白對照組Annexin A7表達量比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

A：siRNA干擾組;B：陰性對照組;C：空白對照組。siRNA：小干擾RNA;Annexin A7：膜聯蛋白A7

圖1 ? Hela細胞siRNA干擾48 h后Annexin A7的表達情況

2.2 免疫熒光激光共聚焦檢測結果

Ki67及P16免疫熒光激光共聚焦結果顯示：其陽性產物在siRNA干擾組、陰性對照組、空白對照組Hela細胞中均有表達，見圖2～3。與陰性對照和空白對照組比較，Ki67陽性產物在siRNA干擾組明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05），而空白對照組和陰性對照組Ki67陽性產物比較差異無統計學意義（P > 0.05）。三組P16陽性產物比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

A：siRNA干擾組;B：陰性對照組;C：空白對照組。siRNA：小干擾RNA

圖2 ? 激光共聚焦細胞免疫熒光顯示siRNA干擾48 h后Ki67在Hela細胞中的表達變化（400×）

A：siRNA干擾組;B：陰性對照組;C：空白對照組。siRNA：小干擾RNA

圖3 ? siRNA干擾48 h后P16在Hela細胞中的表達情況（400×）

表2 ? Hela細胞siRNA干擾48 h后

Ki67和P16的表達（MOD，x±s，n = 9）

注：與陰性對照組比較，*P < 0.05;與空白對照組比較，#P < 0.05。MOD：平均光密度值;siRNA：小干擾RNA

3 討論

Ki67是一種與細胞增殖相關的核抗原，表達于細胞周期的G1、S、G2和M期，與細胞的增殖活性的調控功能相關[9-10]。研究發現其在多種惡性腫瘤如乳腺癌、食管癌、腎細胞癌等均表達異常增高。相關學者[11-12]研究報道Ki67在宮頸病變中隨著宮頸病變級別的升高而表達增加。P16是一種腫瘤抑制基因，參與調控細胞周期，通過阻斷Rb基因的磷酸化，抑制細胞周期進程[13-14]。研究[15-18]顯示，P16蛋白的表達在宮頸癌前病變及宮頸癌中隨著疾病的進展，呈現逐漸增高的趨勢。因此目前臨床及病理中將Ki67和P16聯合使用作為宮頸病變的生物學標記指標，對于輔助診斷、判斷病情、評估發展等發揮重要作用。

Annexin A7是依賴鈣離子的磷脂結合蛋白超家族成員，其在胞膜轉運、信號轉導及細胞分化發展等方面起到重要作用[19-20]，近年來研究發現Annexin A7在惡性腫瘤中如前列腺癌、乳腺癌、胃癌中其蛋白表達產生不同程度的變化[21-22]。本課題前期研究曾報道過Annexin A7在宮頸鱗癌中的表達呈上調現象[7-8]，為了進一步研究其發揮作用的機制，本研究培養宮頸癌細胞株Hela細胞，然后應用siRNA干擾技術降低了Annexin A7在細胞株中的表達，經過Western blot鑒定成功后，用免疫熒光法檢測Hela細胞中Ki67和P16的表達變化。結果顯示，當Annexin A7被干擾表達降低后，siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組Hela細胞的P16表達未發生明顯改變。但是siRNA干擾組Hela細胞Ki67的表達與陰性對照組和空白對照組比較明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。推測Annexin A7基因與細胞增殖功能的調控可能具有某些關系，其可能參與細胞增殖功能的上調作用。然而惡性腫瘤的形成是極其復雜的過程，不但細胞內部各種基因蛋白參與調控，細胞外環境同樣起到重要作用。目前本研究還存在一定的局限性，將在此基礎上繼續擴充試驗，研究其可能機制，為宮頸癌的發生發展及臨床應用提供實驗數據。

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（收稿日期：2019-10-25 ?本文編輯：劉永巧）