糞便基因SDC2和BMP3甲基化聯合檢測在結直腸癌篩查中的價值

潘輝 黃琰瓔 王國新 吳輝 宋慧東 黃穎烽

[摘要] 目的 探討糞便基因黏結蛋白聚糖2（SDC2）和骨形態發生蛋白3（BMP3）甲基化聯合檢測在結直腸癌篩查中的診斷性能。 方法 收集2019年5～9月廣州醫科大學附屬市十二人民醫院和中山大學附屬腫瘤醫院收治的64例患者糞便樣本，其中腸癌組29例、腺瘤組9例、對照組（無結直腸癌、腺瘤患者）26例。提取糞便DNA，使用甲基化特異性PCR方法，檢測三組患者糞便基因SDC2、BMP3甲基化情況，比較診斷結直腸癌、腺瘤的靈敏度和特異度。 結果 糞便基因SDC2和BMP3聯合檢測診斷結直腸癌的靈敏度高于BMP3檢測，差異有統計學意義（P < 0.05）。SDC2、BMP3、聯合檢測診斷結直腸癌AUC值比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。聯合檢測AUC值高于BMP3檢測，差異有統計學意義（Z = 2.361，P < 0.05）。BMP3、聯合檢測對不同分布部位的檢出率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。結論 糞便基因SDC2和BMP3聯合檢測結直腸癌的診斷性能優于BMP3檢測，但與SDC2檢測比較無明顯改善。

[關鍵詞] 結直腸癌;篩查;糞便基因;甲基化;黏結蛋白聚糖2;骨形態發生蛋白3

[中圖分類號] R735.3 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0015-05

Value of combined detection of fecal genes SDC2 and BMP3 methylation in screening for colorectal cancer

PAN Hui1 ? HUANG Yanying2 ? WANG Guoxin3 ? WU Hui1 ? SONG Huidong4 ? HUANG Yingfeng1

1.Department of General Surgery， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou ? 510620， China; 2.Department of Colorectal Surgery， Sun Yat-sen University Cancer Center， Guangdong Province， Guangzhou ? 510060， China; 3.Department of Central Laboratory， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou ? 510620， China; 4.Department of Gastroenterology， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou ? 510620， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic performance of stool gene syndecan-2（SDC2） and bone morphogenetic protein 3（BMP3） methylation in colorectal cancer. Methods Fecal samples were collected from 64 patients admitted to Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University and the Cancer Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University from May to September 2019， of which 29 cases were in the colorectal cancer group， 9 cases were in the adenoma group， and 26 cases were in the control group （patients without colon cancer， adenoma）. Fecal DNA was extracted， and methylation-specific PCR was used to detect the methylation of fecal genes SDC2 and BMP3 of patients in three groups. The sensitivity and specificity of colorectal cancer and adenoma were compared. Results The combined detection of stool gene SDC2 and BMP3 were more sensitive than BMP3 in the diagnosis of colorectal cancer， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The comparison of AUC values of SDC2， BMP3， and combined detection in colorectal cancer were highly statistically significant （P < 0.01）. The AUC value of the combined test was higher than that of the BMP3 test， and the difference was statistically significant （Z = 2.361， P < 0.05）. The detection rate of BMP3 and combined detection on different distribution sites were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The diagnostic performance of stool gene SDC2 and BMP3 detection in colorectal cancer is better than that of BMP3 detection， but there is no significant improvement compared with SDC2 detection.

[Key words] Colorectal cancer; Screening; Fecal genes; Methylation; Syndecan-2; Bone morphogenetic protein 3

在我國，結直腸癌（CRC）是第3位常見惡性腫瘤。據國家癌癥中心報道[1]，2015年新發結直腸癌約38.8萬，因結直腸癌死亡患者約18.7萬。結直腸癌的防控關鍵是早診早治，而篩查是降低死亡率的有效方式。現階段，結腸鏡檢查是結直腸癌篩查的金標準，但由于結腸鏡檢查是侵入性檢查、需繁瑣的腸道準備、有穿孔的風險等，使我國結直腸癌篩查依從性、早診早治率較低。2012～2015年我國城市開展的一項結直腸癌篩查研究報道[2]，在近18.3萬高危人群中，約2.6萬完成腸鏡檢查，參與率為14.0%，相對較低。糞便DNA檢測因其無創、方便、診斷效能高等優點有望成為理想的結直腸癌篩查方式[3-5]。DNA甲基化是腫瘤（包括結直腸癌）發生發展過程中常見的早期事件，檢測特定基因的啟動子區甲基化是結直腸癌檢測的重要生物標志物。黏結蛋白聚糖2（SDC2）是Ⅰ型細胞表面單跨膜蛋白聚糖，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成員。在結直腸癌中，SDC2基因啟動子區常發生異常甲基化，可做為腫瘤標志物用于結直腸癌的篩查[6-8]。骨形態發生蛋白3（BMP3）是BMP家族成員之一，不僅在胚胎發育和器官形成中發揮至關重要的作用，還能調節機體內基因轉錄，與多種癌癥的發生發展密切相關。已有研究顯示[9-10]，BMP3基因在結直腸癌中發揮著抑癌基因的功能。在大多數結直腸癌中，BMP3基因常發生高頻甲基化，已做為腫瘤標志物用于結直腸癌的篩查[3]。由于結直腸癌發生發展過程是多種分子信號途徑參與的遺傳學或表觀遺傳學改變所致，聯合多個基因檢測的診斷性能優于單個基因檢測的診斷性能[11-14]。然而，國內外鮮見在糞便樣本中聯合檢測SDC2和BMP3基因甲基化來篩查結直腸癌的相關研究。因此，本研究以結腸鏡檢查和病理診斷作為“金標準”，利用甲基化特異性PCR（MSP）技術，檢測研究人群糞便基因SDC2、BMP3甲基化狀態，以評價其在結直腸癌篩查中的應用價值，同時評價聯合糞便基因SDC2和BMP3甲基化檢測的診斷性能是否優于單一基因檢測。

1 資料與方法

1.1 糞便樣本收集

本研究選取廣州醫科大學附屬市十二人民醫院和中山大學附屬腫瘤醫院（以下簡稱“我院”）2019年5～9月收治的64例患者的糞便標本，包括腸癌組29例，腺瘤組9例，對照組26例。其中對照組包括非腺瘤性息肉（10例）、其他腸道病變（5例）、全大腸黏膜未見異常（10例）、神經內分泌腫瘤（1例）患者。在腸鏡檢查前或在手術前收集患者糞便，糞便在24 h內保存至-80℃冰箱。所有患者診斷均通過結腸鏡檢查或術后病理診斷，腸癌組病理診斷均為腺癌。根據第8版AJCC結直腸癌分期系統[15]對腺癌進行分期。所有患者術前均未接受化療或放療。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器設備及試劑

T100TMPCR儀、PowerPacTM基礎電泳儀、Gel DocTM EZ System均購自BIO-RAD公司，QIAamp？誖Fast DNA Stool Mini Kit（163025619）、EpiTect？誖Bisulfite Kits（163017560）和EpiTect？誖 PCR Control DNA Set（1630 22382）均購自德國Qiagen公司，Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0）（AJ20771A）和TaKaRa EpiTaqTM HS（for bisulfite-treated DNA）（AIE1877A）購自寶日醫生物技術有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司代為合成。

1.3 糞便DNA提取

所有糞便樣本在處理前隨機編碼，使用糞便DNA提取試劑盒從糞便樣本（180～220 mg）中提取基因組DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 亞硫酸鹽轉化

為驗證提取DNA的質量，針對人源β-actin基因進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系包括：Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）12.5 μL，引物β-actin-F（5′-TGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGT-3′）和β-actin-R（5′-AGCCAATGGGACCTGCTCCTCCCTTGA-3′）各0.4 μmol/L，1 μL糞便DNA。PCR反應條件為：95℃，5 min，95℃，30 s;63℃，30 s;72℃，30 s;40次循環;72℃，10 min。若成功擴增出目的條帶（133 bp），使用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒將基因組DNA進行修飾，將未發生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。

1.5 MSP技術

轉化后的DNA作為模板DNA用于后續MSP技術檢測。25 μL PCR反應體系包括：TaKaRa EpiTaq HS（5 U/μL）0.125 μL，10×EpiTaq PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，dNTP Mixture 3 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA 2 μL。反應條件為：95℃，5 min;95℃，30 s;54～62℃，30 s;72℃，30 s;40個循環;72℃，10 min。EpiTect PCR Control DNA作為陽性對照，水作為陰性對照。擴增產物在3%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，然后進行凝膠成像。甲基化檢測結果判定標準：僅出現甲基化條帶而不出現非甲基化條帶或甲基化和非甲基化條帶均出現視為甲基化;僅出現非甲基化條帶而不出現甲基化條帶視為非甲基化。判定聯合檢測結果陽性的標準是只要有一個基因甲基化陽性即判定該樣本為陽性。引物序列見表1。

表1 ? SDC2和BMP3引物序列

注：M：甲基化;U：非甲基化;F：正義鏈;R：反義鏈。SDC2：黏結蛋白聚糖2;BMP3：骨形態發生蛋白3

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0和MedCalc 15.2統計軟件對所得數據進行分析。計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法。使用ROC曲線評價診斷試驗的準確性，并計算曲線下面積（AUC）。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本信息

腸癌組29例，其中男17例，女12例，平均年齡（57.7±13.7）歲;腺瘤組9例，男7例，女2例，平均年齡（61.1±12.2）歲;對照組26例，男11例，女15例，平均年齡（56.0±15.6）歲。三組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

2.2 糞便基因SDC2和BMP3聯合檢測與單基因檢測比較

聯合檢測結直腸癌靈敏度高于BMP3單基因檢測，差異有高度統計學意義（χ2 = 9.032，P < 0.01）;與SDC2單基因檢測比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。聯合檢測腺瘤靈敏度與SDC2、BMP3單基因檢測靈敏度比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。聯合檢測結直腸癌和腺瘤靈敏度與SDC2、BMP3單基因檢測比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1、表2。

2.3 糞便基因SDC2、BMP3、聯合檢測診斷結直腸癌ROC曲線

SDC2基因（AUC = 0.751，95%CI：0.616～0.857）、BMP3基因（AUC = 0.686，95%CI：0.546～0.804）、聯合檢測診斷（AUC = 0.818，95%CI：0.690～0.909）結直腸癌的AUC值比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。聯合檢測AUC值高于BMP3檢測，差異有統計學意義（Z = 2.361，P < 0.05）。聯合檢測AUC值與SDC2檢測比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.4 腸癌組患者不同臨床特征SDC2、BMP3甲基化陽性率比較

SDC2、BMP3、聯合檢測檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、分化程度比較，差異均無統計學意義（均P > 0.05）。SDC2對不同分布部位檢出率比較，差異無統計學意義（P > 0.05），而BMP3、聯合檢測檢出率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

理想的結直腸癌篩查方式應該具備簡單、方便、人群依從性高等特點，更重要的是診斷性能高。無論是SDC2，還是BMP3，單一基因檢測均能區分結直腸癌、腺瘤和對照患者;然而，單一基因檢測結直腸癌的靈敏度偏低，容易遺漏較多腸癌患者。現階段，局部浸潤、區域侵犯、遠處轉移的結直腸癌患者5年生存率分別為90.0%、71.0%、14.0%[16]。因此，在篩查中需要提高發現Ⅰ～Ⅲ期直腸癌患者靈敏度，對這些患者的獲益更大。聯合檢測診斷結直腸癌的靈敏度高于BMP3檢測，差異有統計學意義（P < 0.05），同時保持較高的特異度;但是，當聯合檢測與SDC2檢測靈敏度比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。本研究結果顯示，聯合檢測優于BMP3檢測，尚不能認為聯合檢測優于SDC2檢測。若需證實糞便基因SDC2和BMP3聯合檢測優于SDC2基因檢測，擴大樣本量可能是一個可行的方式。

另外，本研究結果顯示，所有近端結腸癌患者均未檢測到BMP3基因甲基化，遠端結直腸癌患者BMP3基因甲基化陽性率為56.5%。本研究中，BMP3基因甲基化檢測容易遺漏近端結腸癌患者。然而，Loh等[10]發現，近端結直腸癌組織BMP3基因甲基化陽性率為79.3%，與遠端結直腸癌組織陽性率（30.0%）比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。除引物序列不同和基因組DNA來源不同外，本研究近端結直腸癌患者納入例數較少，也是造成差異的重要原因。

以往研究顯示[17]，糞便基因BMP3甲基化檢測結直腸癌、進展期腺瘤靈敏度分別為40.0%、33.3%，特異度為85.0%，與本研究結果相似。若聯合SFRP2、TFPI2、NDRG4、BMP3檢測，則能提高檢測結直腸癌、進展期腺瘤靈敏度。然而，特異度降至55.0%[17]。柏愚等[13]研究顯示，聯合糞便基因SDC2和SFRP2檢測能夠顯著提高檢測腸癌靈敏度。可見，多靶點檢測是提高診斷結直腸癌靈敏度的有效方式，然而卻降低了特異度。另外，Chen等[18]研究顯示，聯合糞便基因SEPT9、NDRG4、SDC2甲基化檢測能改善單一基因檢測的診斷效能低的不足，但聯合糞便基因BMP3、SEPT9、NDRG4、SDC2甲基化檢測并不能顯著改善診斷準確度。Sun等[19]研究顯示，聯合糞便基因SDC2和SFRP2、KRAS突變和糞便潛血，檢測CRC、腺瘤的靈敏度分別為91.4%、60.0%，特異度為86.1%。以上研究顯示，多靶點糞便基因檢測結直腸癌的診斷效能優于單一基因檢測的診斷性能。多靶點糞便基因檢測已于2016年被納入美國預防服務工作組推薦的結直腸癌篩查方式[20]，但到目前為止，多靶點基因檢測在國內尚處于探索階段。增加1個或多個靶點檢測增加了檢測成本，從眾多腫瘤標志物里篩選出符合國人特性的數個腫瘤標志物不是一件容易的事。因此，建立基于結直腸癌發生發展分子模型的多靶點檢測應該是現階段的研究方向。

本研究存在以下幾點不足：首先，小樣本量造成的分類偏差大，特別是腺瘤組;其次，疾病譜偏倚，所選的對照組不足以代表非結直腸癌、非腺瘤患者，還需納入存在上消化道病變、炎癥性腸病、肝癌等患者;最后，本研究并未獨立進行糞便潛血檢測，無法與糞便潛血檢測的診斷性能做比較。

綜上所述，聯合糞便基因SDC2和BMP3甲基化檢測結直腸癌的診斷性能優于BMP3檢測，但與SDC2檢測比較無明顯改善。

[參考文獻]

[1] ?鄭榮壽，孫可欣，張思維，等.2015年中國惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019，41（1）：19-28.

[2] ?Chen H，Li N，Ren J，et al. Participation and yield of a population-based colorectal cancer screening programme in China [J]. Gut，2019，68（8）：1450-1457.

[3] ?Imperiale TF，Ransohoff DF，Itzkowitz SH，et al. Multitarget stool DNA testing for colorectal-cancer screening [J]. N Engl J Med，2014，370（14）：1287-1297.

[4] ?Bosch LJW，Melotte V，Mongera S，et al. Multitarget Stool DNA Test Performance in an Average-Risk Colorectal Cancer Screening Population [J]. Am J Gastroenterol，2019， 114（12）：1909-1918.

[5] ?Mu J，Huang Y，Cai S，et al. Plausibility of an extensive use of stool DNA test for screening advanced colorectal neoplasia [J]. Clin Chim Acta，2020，501：42-47.

[6] ?Oh T，Kim N，Moon Y，et al. Genome-wide identification and validation of a novel methylation biomarker，SDC2，for blood-based detection of colorectal cancer [J]. J Mol Diagn，2013，15（4）：498-507.

[7] ?Niu F，Wen J，Fu X，et al. Stool DNA Test of Methylated Syndecan-2 for the Early Detection of Colorectal Neoplasia [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2017，26（9）：1411-1419.

[8] ?Han YD，Oh TJ，Chung TH，et al. Early detection of colorectal cancer based on presence of methylated syndecan-2（SDC2）in stool DNA [J]. Clin Epigenetics，2019，11（1）：51.

[9] ?Wen J，Liu X，Qi Y，et al. BMP3 suppresses colon tumorigenesis via ActRⅡB/SMAD2-dependent and TAK1/JNK signaling pathways [J]. J Exp Clin Cancer Res，2019，38（1）：428.

[10] ?Loh K，Chia JA，Greco S，et al. Bone morphogenic protein 3 inactivation is an early and frequent event in colorectal cancer development [J]. Genes Chromosomes Cancer，2008，47（6）：449-460.

[11] ?蔡克銀，徐梅華，王曉.糞便DNA中聯合SFRP1及SEPT9基因甲基化檢測對老年性結直腸癌早期診斷的臨床研究[J].臨床腫瘤學雜志，2018，23（1）：25-29.

[12] ?Zhang H，Zhu YQ，Wu YQ，et al. Detection of promoter hypermethylation of Wnt antagonist genes in fecal samples for diagnosis of early colorectal cancer [J]. World J Gastroenterol，2014，20（20）：6329-6335.

[13] ?柏愚，劉晶，康倩，等.聯合檢測SDC2和SFRP2甲基化在結直腸癌篩查中的價值[J].中華消化內鏡雜志，2019， 36（6）：427-432.

[14] ?肖著軍，王新穎，李丙生，等.聯合檢測vimentin和SFRP2甲基化在大腸癌篩查中的應用評價[J].現代消化及介入診療，2014，19（1）：13-16.

[15] ?Amin MB，Edge S，Greene F，et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed [M]. New York：Springer，2017.

[16] ?Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2019 [J]. CA Cancer J Clin，2019，69（1）：7-34.

[17] ?Park SK，Baek HL，Yu J，et al. Is methylation analysis of SFRP2，TFPI2，NDRG4，and BMP3 promoters suitable for colorectal cancer screening in the Korean population？ [J]. Intest Res，2017，15（4）：495-501.

[18] ?Chen J，Sun H，Tang W，et al. DNA methylation biomarkers in stool for early screening of colorectal cancer [J]. J Cancer，2019，10（21）：5264-5271.

[19] ?Sun M，Liu J，Hu H，et al. A novel panel of stool-based DNA biomarkers for early screening of colorectal neoplasms in a Chinese population [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2019，145（10）：2423-2432.

[20] ?US Preventive Services Task Force，Bibbins-Domingo K，Grossman DC，et al. Screening for Colorectal Cancer： US Preventive Services Task Force Recommendation Statement [J]. JAMA，2016，315（23）：2564-2575.

（收稿日期：2019-12-08 ?本文編輯：王曉曄）