擬南芥中染色質重塑因子的功能

張洪亞，楊紅春

（雜交水稻國家重點實驗室（武漢），武漢大學生命科學學院，湖北 武漢 430072）

真核生物基因組的遺傳信息，儲存在以核小體為基本單位的染色質中。染色質的高級結構在壓縮細胞核DNA的同時，其致密結構也嚴重影響DNA復制、基因表達等細胞過程[1]。因此，生物體進化出一系列的染色質重塑酶類和相關蛋白因子，調節局部染色質的開放性，使轉錄因子等蛋白能夠直接結合核小體DNA，保障這些生命活動的順利進行。這種動態調控染色質結構的過程稱為染色質重塑（chromatin remodeling）。

真核生物中廣泛存在一類染色質重塑復合體（chromatin remodeling complex），通過水解ATP獲得能量，調節染色質的結構。該類復合體一般是由4-17個亞基組成，其核心亞基為Snf2蛋白家族的染色質重塑因子（chromatin remodeler）[2]，具有保守的ATPase催化結構域，該結構域包含SNF2_N（DEADc）和HELICc 兩個部分，具有ATP結合位點和水解ATP的催化中心[3]。染色質重塑復合體通過核小體滑動、移除、組蛋白變體替換等方式參與DNA復制、損傷修復、細胞周期維持等過程[4]。擬南芥基因組中有41個染色質重塑因子，目前有功能研究的不足10個，并且只有極少數的研究將生化活性和功能聯系了起來。擬南芥中染色質重塑復合體的功能具有多樣性，全面的解析復合體的組成、各亞基的功能以及亞基間的相互關系、并把功能和生化活性聯系起來，已經成為表觀遺傳學研究的熱點和難點。

1 染色質重塑復合體的分類

利用生物信息學的方法，在54種真核生物、24種古細菌和269種原核生物基因組中共鑒定到1306個具有保守ATPase催化結構域的Snf2家族成員，分為24個亞家族，其中11個亞家族在真核生物中普遍存在[2]。擬南芥基因組中的41個染色質重塑因子，可以分為18個亞家族（見圖1）。但染色質重塑因子往往還包含其他的功能結構域，并在復合體中發揮功能，因此這種分類方法不能很好的體現其功能特征，也不利于預測其功能。根據真核生物中染色質重塑復合體的功能特性，并結合核心亞基的ATPase結構域及鄰近結構域的特征，又可以分為四個家族：SWI/SNF（mating type switching/sucrose nonfermenting）家族包含一個Bromodomain或一個HAS（helicase-SANT）結構域；ISWI（imitation switch）家族含有一個SANT-SLIDE結構域模塊；CHD（chromodomain helicase DNA-binding）家族含有Chromodomain結構域；INO80（inositol autotroph 80）家族的顯著特征是DEADc和HELICc結構域之間有約300個氨基酸的連接序列[4，5]。

2 染色質重塑復合體的調節機制

2.1 組蛋白修飾

染色質重塑因子通過與特異的組蛋白修飾酶類相互作用，調節相應的組蛋白修飾。BRM（CHR2，BRAHMA）與植物特異的H3K27去甲基酶REF6（RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6）相互作用，作為復合體發揮功能[6]。SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）能招募REF6和BRM結合到TFS1（TARGET OF FLC AND SVP 1）染色質上，去除H3K27me3修飾，并降低TFS1基因3’端的SOC1、REF6和BRM結合位點附近的核小體占有率，使染色質更容易被轉錄因子和其他蛋白結合，從而促進TFS1的轉錄[7]。同時BRM可以作為TrxG蛋白拮抗PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）的功能，從而動態調控H3K4me3和H3K27me3在靶基因上的水平和分布[8，9]。PKL（CHR6，PICKLE）也具有TrxG類似的功能，可與H3K4甲基轉移酶ATX1（ARABIDOPSIS HOMOLOG OF TRITHRIX 1）相互作用，通過提高FT（FLOWERING LOCUS T）上H3K4me3的修飾，促進FT的表達[10]。研究也發現DDM1（CHR1，DECREASE IN DNA METHYLATION 1）具有維持異染色質區域H3K9甲基化，介導H4K16去乙酰化的作用[11]。染色質重塑復合體可以調節特定基因上組蛋白修飾水平、不同修飾類型的相互轉換，調節基因表達，但要明確二者之間的相互關系、作用機制，需要系統地鑒定染色質重塑復合體的亞基、起橋梁作用的中間因子和分析靶基因的特征，從而解析其調節機制。

2.2 核小體移動

核小體是真核生物染色質的基本組成單元，其分布特性決定局部染色質的開放程度，從而調節基因轉錄[12]。染色質重塑因子能夠改變核小體位置、占有率（在特定位置形成核小體結構的比例），從而調節基因的表達。ISWI家族通過移動核小體，調節核小體在基因上的分布和核小體間隔。擬南芥ISWI家族的CHR11（CHROMATIN REMODELING 11）、CHR17在體外能將DNA片段末端的核小體移動到中間位置[13]，在chr11 chr17雙突變體中，核小體在基因體（gene body）的分布模式改變，但密度不變[12]。PKL在動物中的同源蛋白Mi-2與組蛋白去乙酰化酶HDAC（Histone Deacetylase）形成穩定的復合體發揮作用，但在擬南芥中以單體形式存在，具有ATP依賴的核小體移動能力。體外實驗條表明PKL能結合雙鏈DNA和單核小體，但只有單核小體可以激活其ATPase活性，將DNA鏈末端的核小體移動到中心位置，而一般不移動中心位置的核小體[14]。DDM1有PKL類似的核小體移動特性，但效率較低，暗示可能需要在完整復合體背景中才能發揮最大的活性[15]。BRM通過提高基因轉錄起始位點（TSS，transcription start site）附近區域核小體的占有率，使染色質結構較為緊密，抑制基因表達，例如，提高ABI5（ABA INSENSITIVE 5）的TSS下游+1核小體占有率抑制基因表達[16]。相反，CHR5在全基因組的水平上降低啟動子區域的核小體占有率，使局部染色質處于易于被調節因子結合的開放狀態，促進基因的表達[17]。

2.3 組蛋白變體替換

經典組蛋白由多個序列高度相似的基因編碼，主要在細胞周期的DNA合成期（S期）表達，與DNA復制密切相關。組蛋白變體的氨基酸序列和物理性質不同于經典組蛋白，在整個細胞周期中表達。因此組蛋白變體可以在整個細胞周期中插入染色質的特定區域，參與調節各個時期的生長發育[18]。Ino80和Swr1是INO80家族的ATPase活性亞基，酵母INO80復合體催化核小體的滑動、移除啟動子上未乙酰化的組蛋白變體H2A.Z，維持基因組穩定[19]。擬南芥INO80（CHR21）調節眾多的生長發育和環境響應相關的基因，這些基因上都富含H2A.Z變體，INO80直接與H2A.Z相互作用，促進H2A.Z在開花抑制因子FLC、MAF4/5（MADS AFFECTING FLOWERING 4/5）基因上的分布，這與酵母中的情況有所區別[20]。SWR1復合體促進H2A.Z/H2B二聚體替換TSS +1核小體上的H2A /H2B二聚體[19]。H2A.Z組蛋白變體替換是逐級、單向進行的，核小體結構和H2A.Z/H2B二聚體都可以激活SWR1復合體ATPase活性，既是其底物又是產物[21]。SWR1復合體在擬南芥與酵母中有眾多同源亞基，通過對含有ATPase的核心亞基PIE1（PHOTOPERIOD INDEPENDENT EARLY FLOWERING 1，CHR13）突變體和編碼H2A.Z組蛋白變體的hta8 hta9 hta11三突變體的遺傳分析發現，擬南芥SWR1復合體也催化H2A.Z/H2B取代H2A/H2B。同時hta8 hta9 hta11的表型要強于pie1，暗示可能存在PIE1以外的機制將H2A.Z插入核小體[22]。擬南芥SWR1復合體的組分SWC4能夠識別TSS附近沒有核小體的DNA區域（NFR，nucleosome-free DNA region）的AT-rich序列，招募PIE1蛋白復合體，并促進H2A.Z插入+1核小體，從而調節染色質的狀態，促進發育相關和環境響應基因的正確表達，而不是單一地發揮促進或者抑制轉錄的功能[23]。在酵母和動物中，H2A.Z同時在+1和-1核小體富集，暗示擬南芥SWR1復合體對H2A.Z的插入具有特異的調節作用。同時擬南芥SWR1復合體也有特異的亞基：包括含有CpG甲基化結合結構域的MBD9、ISWI染色質重塑蛋白CHR11和CHR17、組蛋白乙酰轉移酶NuA4復合體的亞基TRA1a和TRA1b，暗示組蛋白變體H2A.Z的插入、核小體移動、組蛋白乙酰化協同作用，共同調節基因表達和生長發育[13]。除了H2A.Z，組蛋白H2A還有其他的變體，染色質重塑復合體是否也調節這些變體的分布和置換、采用什么樣的調節機制，還有待進一步的研究。我們相信解析H2A.Z的分布和置換的詳細機制對于解決這些問題有重要的參考意義。

2.4 DNA甲基化

RNA依賴的DNA甲基化（RdDM，RNA-dependent DNA methylation），能夠抑制轉座子和重復序列的表達，保持基因組的完整性。在RdDM中，Pol Ⅳ（Polymerase IV）產生的siRNA（small interfering RNA）裝載到AGO4（ARGONAUTE 4）蛋白上，同時Pol Ⅴ結合到靶基因上轉錄lncRNA（long noncoding RNA），招募AGO4-siRNA復合體，siRNA通過互補序列結合到靶基因，并招募DNA甲基化酶，實現基因的甲基化[24]，染色質重塑因子也是RdDM的重要組成部分。CLSY（CLASSY）家族的成員：CLSY1（CHR38）、CLSY2（CHR42）、CLSY3（CHR31）、CLSY4（CHR40）與Pol Ⅳ結合，調節Pol Ⅳ與靶基因的結合，以及siRNA 的轉錄[25]。DRD1（CHR35，DEFECTIVE IN RNADIRECTED DNA METHYLATION 1）與RdDM中的另外兩個蛋白：DMS3（DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING 3）和 RDM1（RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1）形成DDR復合體，招募Pol Ⅴ到靶基因上[26]。PKL則與Pol Ⅴ協同作用，穩定特定靶基因位點的核小體結構并促進lncRNA轉錄[27]。CHR19、CHR27、CHR28與SUVR2互相作用，維持特定靶基因上由Pol Ⅴ穩定的核小體結構，SUVR2還與SUVR1形成復合體，共同促進DNA甲基化和基因沉默[28]。DDM1協助DNA甲基轉移酶克服核小體結構和連接組蛋白H1的阻礙，幫助甲基轉移酶接觸核小體DNA，從而促進轉座子的DNA甲基化[29]。還有研究表明，lncRNA能通過IDN2（INVOLVED IN DE NOVO 2）招募包含SWI3B亞基的染色質重塑復合體，從而改變靶基因的核小體結構，促進其DNA甲基化[30]。

在擬南芥中，RdDM與ROS1（REPRESSOR OF SILENCING 1）依賴的DNA去甲基化，動態調節特異位點的DNA甲基化。對CLSY各成員的突變體分析表明，CLSY可能參與ROS1依賴的特定位點的DNA去甲基化[31]。SWR1復合體被IDM1（INCREASED DNA METHYLATION 1）招募到甲基化的基因上，將H2A.Z組蛋白變體插入靶基因，而H2A.Z與ROS1互相作用，促進DNA的去甲基化[32]。

這些研究表明，染色質重塑因子在不同的層面上調節DNA甲基化，既可以通過RdDM調節DNA甲基化；也可以與ROS1相互作用，調節DNA的去甲基化，暗示染色質重塑因子在調節DNA甲基化的動態平衡中起重要作用。

3 染色質重塑因子的功能

3.1 調節MicroRNA的積累

miRNA（MicroRNA）是一系列21nt 的非編碼RNA，通過剪切靶基因mRNA或抑制其翻譯，調節基因表達，參與植物生長發育的調控[33]。染色質重塑因子可以調節miRNA基因的表達、pri-miRNA（primary microRNA precursor）的剪切等過程，調節miRNA的積累。例如BRM可以直接結合MIR156A啟動子，降低TSS附近-2和+1核小體占有率，拮抗PRC2的功能，降低H3K27me3的修飾水平，促進MIR156A的表達和miR156的積累[34]。相反，PKL結合MIR156A、MIR156C的啟動子，促進PRC2與基因的結合，提高H3K27me3修飾水平和+1核小體占有率，從而抑制miR156的積累[35]。SWR1復合體通過促進H2A.Z的富集，促進MIR156A、MIR156C基因上H3K4me3的水平，促進種子萌發時miR156的積累[36]。這些結果暗示不同的染色質重塑因子可以通過控制核小體占有率和染色質的修飾，調節miRNA基因的表達，控制其功能。BRM除了調節miRNA基因的表達，還可調控pri-miRNA的剪切。研究發現BRM與miRNA剪切組分SE（SERRATE）相互作用，利用ATPase的活性改變pri-miRNA的二級結構，抑制剪切復合體的活性，從而降低miRNA的積累[37]。這項研究也表明pri-miRNA可以作為染色質重塑因子的底物，暗示染色質重塑因子除了調控染色質的結構，還可能通過調控DNA或者RNA的二級機構，調節基因的功能。

3.2 激素響應

不同的染色質重塑復合物通過響應不同的激素信號因子和感知因子，調節激素合成和信號途徑中的基因表達，參與激素響應。PKL通過與PIF3（PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 3）和BZR1（BRASSINAZOLERESISTANT 1）的相互作用，整合光、油菜素內酯（BR）和赤霉素（GA）信號調節下胚軸伸長。在暗環境中，PIF3和BZR1招募PKL到細胞伸長相關的基因上，抑制H3K27me3積累，促進相關基因的表達，從而促進細胞的伸長。在光照條件下，光信號降低GA的水平，促進DELLA蛋白積累，DELLA蛋白與PKL結合，削弱其與PIF3和BZR1的結合能力，負調控細胞伸長[38]。PKL還控制幼苗中80%響應GA信號并參與調節細胞伸長、細胞分裂、生長時期轉換的相關基因的表達[39]。BRM通過調節ABI5基因的表達響應脫落酸（ABA），當遭遇干旱脅迫時，SNRK2（SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 2）磷酸化BRM，抑制其活性，ABI5活躍表達，植物響應脫落酸，暫時停滯生長以保護細胞和組織不受損傷；度過逆境后，PP2C（PHOSPHATASES TYPE 2C）將BRM去磷酸化激活，抑制ABI5參與的脫落酸響應[40]。BRM也是GA響應的正向調節因子，細胞分裂素響應的負調控因子，還調節生長素信號在根的分布[41，42]。水楊酸合成和代謝相關基因的表達受到DDM1的調節，ddm1-F1（ddm1與不同背景野生型雜交的F1代）植株體內最適的水楊酸水平改變，雜種優勢丟失[43]。

3.3 逆境響應

植物在整個生活周期中都可能遭遇不同的逆境脅迫，而染色質重塑復合體能夠調控各類逆境響應基因的表達，在逆境響應中既有積極作用也有消極影響。在brm突變體中，ABI5活躍表達，因此具有更強的抗旱能力[40]。同時，brm對鹽和高濃度硼脅迫，都具有更強的耐性[44，45]。說明BRM對這三種逆境脅迫更為敏感。在寒冷脅迫下，PKL調節低溫響應的關鍵因子CBF3（C-REPEAT BINDING FACTOR 3）的表達，從而調節一系列寒冷響應基因的表達，增強植物對寒冷環境的耐性；PKL還參與植物鹽脅迫耐性的調控[46]。在高溫（37℃、42℃）、干旱、鹽脅迫下，CHR12暫時地抑制植物的生長發育從而躲避不利環境[47]。低鉀抑制生長素轉運因子PIN3的表達，引起生長素響應抑制因子IAA27（INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 27）的降解和生長素信號途徑的缺陷，抑制植物側根形成。此時CLSY1通過RdDM抑制IAA27的轉錄，從而促進生長素響應基因的轉錄，作為一個獨立的后備途徑促進側根發育[48]。SWR1復合體組分PIE1或SWC6（SWR1 COMPLEX SUBUNIT 6）在擬南芥抵抗病原菌入侵中是正調控因子，而APR6（ACTIN-RELATED PROTEIN 6）是負調控因子[49]，表明染色質重塑復合體的不同組分對特定的過程有不同的調控作用，暗示這些組分可能有獨立的功能。在生物脅迫和非生物逆境中，染色質重塑復合體不具有廣譜抗性，而是參與特定類型的逆境響應，深入解析相關作用機制，將有利于在農業生產上培育抵抗特定逆境的優良作物。

3.4 調節生長發育

染色質重塑復合體調節的基因類型眾多，涉及植物生命周期的各個階段，對擬南芥完成生活史具有重要意義。目前研究最為廣泛的BRM，主要分布在分生組織、器官原基等細胞活躍分裂的組織中，在植物營養生長、胚胎發育、生殖發育和干細胞維持過程中發揮重要作用。brm突變體植株變小、葉片小而卷曲、根長顯著變短、花藥育性降低、花期提前[50]。PKL調節與GA信號途徑相關的幼年期向成年期轉變、營養生長向生殖生長的轉變，還促進孢子體和配子體世代之間的信號交流[51，52]。與PKL同源的CHR4參與自主開花途徑，促進開花[53]。與酵母、動物中類似，ISWI家族的CHR11、CHR17的SLIDE結構域可以與包含DDT結構域的大多數蛋白結合，與RLT1（RINGLET 1）和RLT2的相互作用維持擬南芥的營養生長[54，55]。ARP6和CHR11調節雌配子體中特定基因的時空表達，ARP6促進雌配子體減數分裂相關基因的表達，在體細胞中則抑制相關基因的表達[56]。CHR11在雌配子體形成過程中，促進單倍體細胞核的繁殖；在孢子體發育過程中，促進細胞的數量增加[57]。CHR12和CHR23在擬南芥中研究甚少，單基因突變植株無明顯生長缺陷，雙突變體胚胎致死[58]。

4 總結與展望

染色質重塑復合體通過改變、修飾染色質的結構，或者與轉錄因子相互作用或識別特定的組蛋白修飾被招募到靶位點[32，38]，調節基因轉錄，并參與逆境響應，從而保障植物正常生長發育。其核心亞基能夠調節特定染色質的結構，其他的亞基也能夠響應不同的信號，從而共同參與復雜的基因互作網絡，為復合體作用方式和功能的多樣性提供了基礎。在植物中，研究和鑒定更多類型的招募因子和直接靶基因，有助于解析目前未被研究的染色質重塑因子的功能，也有利于更加準確、全面的闡釋染色質重塑復合體的招募和調節機制。

研究還發現染色質重塑復合體的活性受到諸多因素的調節，例如激活ATPase活性所需核酸類型因ATPase催化結構域而異，無核小體結構的DNA和核小體DNA可以同等的激活SWI/SNF家族的酶活性，而完全激活ISWI家族則需要核小體DNA[59]。在植物中，BRM的活性還受到磷酸化、蘇素化（SUMOylation）修飾的調節[40，60]。因此闡釋染色質重塑復合體活性調節方式，并建立活性與功能的關系，將為其調控網絡賦予新的含義。同時鑒定各個復合體的亞基組成、闡述各亞基的功能、以及亞基之間的相互關系，這些都將是未來研究的重點和難點。