欖香烯對人膠質瘤U251細胞的放射增敏機制*

汪 鳳，朱 婷，關曉燕，2，李 玲，周衛兵△

（1中南大學湘雅醫院腫瘤科，湖南長沙410008；2中國科學院合肥腫瘤醫院腫瘤科，安徽合肥230071；3中南大學湘雅醫院分子醫學研究中心，湖南長沙410008）

高級別膠質瘤（high-grade gliomas，HGGs）包括WHOⅢ、Ⅳ級膠質瘤，是腦原發性腫瘤中發病率最高、最難治療的一類腫瘤，因腫瘤無完整的包膜，呈浸潤性生長，與腦組織分界不清，手術難以根除。目前標準治療方案為手術聯合術后放療和（或）同步替莫唑胺化療［1-2］。放療能延長患者的無疾病進展生存期［3］，但往往因放射抵抗導致復發，降低生存時間。因此通過藥物、生物以及物理等手段增強高級別膠質瘤的放療敏感性已成為近年研究重點之一。

欖香烯（elemene）是從姜科植物溫莪術（郁金）中提取出來的萜烯類化合物，主要包括β-欖香烯、γ-欖香烯和δ-欖香烯3種，其中具有明確抗癌活性的成份是β-欖香烯（1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙烯基環己烷）。1994年欖香烯乳狀注射液作為國家二類非細胞毒性抗腫瘤新藥上市［4-5］，但乳劑存在一些缺陷，如靜脈炎發生率高、低溫耐受性差等。石藥集團對劑型進行改良升級，于2012年上市水針劑型的欖香烯注射液，為無色澄明粘稠液體，均相體系顯著降低了使用者靜脈炎的發生率，其β-欖香烯含量高達96%以上，雜質含量低且產品穩定性良好。大量研究［6-10］證實，欖香烯能通過血腦屏障，具有廣譜、高效、低毒等特點，對包括膠質瘤在內的多種腫瘤表現出抗腫瘤作用。目前欖香烯注射液聯用化療藥開展的臨床試驗涉及惡性胸腹腔積液、多種實體瘤以及腦轉移癌等，并取得了一定的療效［11-12］，具有毒副作用小（如對肝、腎功能無明顯損害，不發生骨髓抑制）、長期使用無明顯耐藥性等優點。欖香烯亦具有放射增敏作用，但目前研究主要集中于肺癌，而對于膠質瘤增敏作用的研究未見報道。我們前期發現了欖香烯對U251細胞有放射增敏作用［13］，但具體機制尚不清楚，本文將欖香烯對人腦膠質瘤U251細胞株的放射增敏作用機制進行研究。

材料和方法

1 材料

人膠質瘤U251細胞（中南大學細胞分子實驗室）。欖香烯注射液［石藥集團遠大（大連）制藥有限公司，國藥準字H20110114，規格為每支0.2 g/10 mL］；annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；鼠抗人細胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，Cdc2）、survivin和βactin抗體及羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP抗體（Santa Cruz）；兔抗人 p-Cdc2（Thr161）和cyclin B1抗體（Cell Signaling）。

2 儀器與設備

超凈工作臺（上海申力科學儀器公司）；ELx800型酶標儀（BioTek）；FACSCalibur流式細胞儀（BD）；直線加速器（Siemens）。

3 方法

3.1 細胞培養 人腦膠質瘤U251細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃飽和濕度的CO2培養箱。

3.2 MTT法檢測細胞活力 接種對數生長期細胞于96孔培養板（每孔4×103個細胞），設調零組、對照組（0 mg/L）及欖香烯（10、20、40、80和160 mg/L）組，每組設6個重復孔。常規培養24 h后，予以不同濃度藥物處理，繼續培養24 h后加入MTT液20 μL，孵育4 h后吸棄，再加入DMSO 150 μL，酶標儀490 nm波長處測定吸光度（A490）。細胞相對活力（%）=（欖香烯組A490-調零組A490）/（對照組A490-調零組A490）×100%。設調零組、對照組（0 mg/L+0 Gy）、欖香烯組（40 mg/L+0 Gy）、放療組（0 mg/L+2、4、6、8 Gy）及聯合組（40 mg/L+2、4、6、8 Gy），每組設6個重復孔，予以欖香烯40 mg/L處理24 h后，放療組及聯合組置于直線加速器（200 cGy/min，源皮距100 cm），按設定劑量進行照射。各組繼續培養24 h后，予以MTT法檢測各組光吸收值A490。放射組細胞相對活力（%）=（放射組A490-調零組A490）/（對照組A490-調零組A490）×100%，去除藥物毒性作用聯合組細胞相對活力（%）=（聯合組A490-調零組A490）/（藥物組A490-調零組A490）×100%。

3.3 細胞分組及處理 將3×105個細胞接種于100 mL培養瓶，設對照組（0 mg/L+0 Gy）、放療組（0 mg/L+3 Gy）、欖香烯組（40 mg/L+0 Gy）及聯合組（40 mg/L+3 Gy），每組設6個平行瓶。

3.4 細胞周期及細胞凋亡的檢測 收集細胞，予以冰的70%乙醇固定，再加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料4℃避光染色，流式細胞術檢測細胞周期。另收集細胞用預冷的PBS洗滌2次，4℃、300×g離心1 min，細胞用緩沖液（binding buffer）重懸細胞。然后加入annexin V/PI雙染色，再加入binding buffer制樣，流式細胞術檢測各組細胞凋亡。

3.5 Western blot檢測蛋白表達的水平 收集各組細胞，加入含10%cocktail蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑細胞裂解液冰上裂解40 min，4℃、14 000×g離心15 min，收集上清，測定蛋白濃度。SDS-PAGE膠分離蛋白，再將凝膠中的蛋白電轉移至硝酸纖維素濾膜，I抗 4℃孵育 24～48 h，II抗室溫下孵育 1 h。ECL試劑發光壓片顯影。應用ImageJ軟件檢測條帶灰度，計算各蛋白相對表達量。

4 統計學處理

以SPSS 23.0軟件進行數據統計。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組比較采用方差分析+兩兩比較HSD-q檢驗，多時點觀測資料采用兩因素重復測量方差分析+組間兩兩比較HSD-q檢驗+時間兩兩比較差值t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 欖香烯對U251細胞活力的影響

欖香烯處理U251細胞24 h后，各濃度欖香烯處理組的細胞活力均低于對照（0 mg/L）組（P＜0.05）；U251細胞活力隨欖香烯濃度增高而降低，欖香烯對U251細胞活力的抑制作用具有劑量依賴性，半數抑制濃度（IC50）為72.0 mg/L，見圖1。

Figure 1.Inhibitory effect of elemene on the viability of U251 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 0 mg/L group.圖1 欖香烯對U251細胞活力的抑制作用

2 欖香烯（40 mg/L）對U251細胞放射敏感性的影響

欖香烯濃度為40 mg/L的聯合組中，接受不同劑量放療的細胞活力均低于欖香烯濃度為0 mg/L的單獨放射組（P＜0.05），表明40 mg/L欖香烯具有放射增敏作用。鑒于單獨放射組細胞活力在3 Gy劑量時出現下降（P＜0.05），故選用40 mg/L欖香烯聯合3 Gy放療進行后續研究。見圖2。

3 欖香烯對細胞凋亡及細胞周期的作用

欖香烯與放療在U251細胞的早期凋亡率（P=0.047）、繼發性壞死率（P=0.008）、總死亡率（P=0.004）及G2/M期阻滯（P=0.032）方面存在交互作用。放射組細胞早期凋亡率、繼發性壞死率和總死亡率相對于對照組有增高趨勢，而G2/M期細胞比例降低；欖香烯與放射聯合作用進一步提高細胞早期凋亡率、繼發性壞死率及總死亡率（P＜0.05），G2/M期細胞比例亦顯著升高（P＜0.05）；欖香烯組細胞早期凋亡率、總死亡率及G2/M期細胞比例相對于空白組均顯著增高（P＜0.05），提示欖香烯通過誘導U251細胞G2/M期阻滯和早期凋亡、提高細胞總死亡率而發揮其放射增敏作用。見圖3。

Figure 2.Radiosensitizing effect of elemene on the U251 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 0 mg/L elemene group.圖2 欖香烯對U251細胞的放射增敏效應

4 欖香烯對細胞周期及細胞凋亡相關蛋白表達作用

Western blot結果顯示，欖香烯藥物治療與放療對cyclin B1蛋白存在交互作用（P=0.007）。單獨放射組cyclin B1蛋白表達與對照組相比顯著提高（P＜0.05）；與單獨放射組相比，聯合組cyclin B1表達顯著降低，提示欖香烯能夠拮抗放療誘導的cyclin B1表達增高，降低cyclin B1表達。此外，欖香烯可顯著降低Cdc2、p-Cdc2（Thr161）和survivin蛋白水平（P＜0.05）。見圖4。

討 論

放療是膠質瘤的重要輔助治療方式之一，但腫瘤周圍存在重要組織器官、腫瘤細胞內在放療敏感性差、術后腫瘤供血供氧不足而產生放療抵抗或耐放射性等，常導致療效下降。所以，通過放療和放射增敏劑聯合使用的方法或可提高療效。研究發現，欖香烯可抑制多種腫瘤，具有毒副作用小、逆轉腫瘤耐藥等特點，欖香烯具備臨床放射增敏劑的潛能。欖香烯在其它實驗［14-16］證明對膠質瘤 U87、C6和U251細胞系體外具有增殖抑制作用。本研究結果顯示，欖香烯作用24 h對膠質瘤U251細胞的IC50為72.04 mg/L，表明欖香烯對U251細胞體外亦具有增殖抑制作用，與前期實驗［13］實驗結果相近。

Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and the cell cycle distribution.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs radiation group.圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期分布的變化

欖香烯可能通過參與調控細胞增殖、凋亡、DNA損傷修復、信號通路活性等途徑發揮放射增敏作用。本實驗發現欖香烯通過誘導U251細胞G2/M期阻滯和早期凋亡、提高細胞總死亡率而發揮其放射增敏作用。細胞增殖依賴于有絲分裂，并主要由3個檢查點（G1/S檢查點、G2/M檢查點和紡錘體組裝檢查點）調控細胞有絲分裂周期的不可逆運行［17］。目前，有關G2檢查點的應答通路尚未完全闡明，但有研究證實Cdc2活性在此過程中發揮關鍵作用［18］，而且cyclin B-Cdc2復合物形成及Cdc2激活推動細胞G2/M期轉換。本研究結果表明，欖香烯能夠降低Cdc2蛋白表達，同時拮抗放療誘導的cyclin B1表達增高，抑制cyclin B1表達，初步證實欖香烯聯合放療可抑制cyclin B-Cdc2復合物形成，導致細胞G2/M期阻滯。Cdc2蛋白活性通過大量磷酸化反應調控，Cdc2蛋白存在一個正性調節位點（Thr161）及2個負性調節位點（Thr14及Tyr15）。磷酸化Cdc2第161位蘇氨酸可激活Cdc2，促進細胞G2/M期轉換。相反，磷酸化Cdc2兩個負性調節位點則抑制Cdc2活性，導致細胞G2/M阻滯。我們進一步研究發現欖香烯能夠抑制Cdc2第161位蘇氨酸磷酸化，導致p-Cdc2（Thr161）蛋白水平降低，抑制Cdc2活性，進而導致細胞于G2/M期阻滯。大量研究證實，G2期及M期細胞對放療最敏感，S期細胞對放療耐受性最強，且G2/M期細胞放射敏感性比S期細胞高近3倍［19］。有研究發現，欖香烯可誘導非小細胞肺癌和卵巢癌細胞發生G2/M期阻滯。另外，陳琦等［6］報道β-欖香烯亦可通過降低cyclin B1和p-Cdc2（Thr161）蛋白水平誘導非小細胞肺癌細胞發生G2/M期阻滯。這些研究進一步證實欖香烯可在不同類型的腫瘤中引起G2/M期阻滯，從而達到放射增敏的作用。

Figure 4.The expression of G2/M check point-related proteins and protein level of survivin.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs radiation group.圖4 G2/M檢測點相關蛋白及survivin蛋白表達的變化

既往研究表明，survivin高表達的膠質瘤表現出放射抵抗［20-22］。也有人認為survivin可抑制caspase-3、caspase-7［23-25］和caspase-9［26］的活化而抑制其介導的細胞凋亡；survivin還能與Smac（second mitochondria-derived activator of caspase）/DIABLO（direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI）結合，發揮抑制細胞凋亡功能［27］。本實驗運用Western blot檢測survivin蛋白表達，發現欖香烯能顯著降低其在膠質瘤U251細胞系中表達，提示欖香烯能夠降低U251細胞survivin蛋白表達，誘導細胞凋亡，從而增強放療作用。但誘導凋亡的具體途徑有待進一步研究。

綜上所述，欖香烯可抑制人膠質瘤U251細胞活力，增強其放射敏感性；欖香烯可降低Cdc2和cyclin B1蛋白表達，進而抑制cyclin B-Cdc2復合物形成；欖香烯可能抑制Cdc2蛋白磷酸化，降低Cdc2活性，導致細胞G2/M期阻滯，增強細胞放射敏感性；欖香烯還可能通過下調survivin表達，誘導細胞凋亡。