基于NF-κB/JNK信號通路研究他克莫司對脊髓損傷模型大鼠的調節作用

張七妹，柴 芳*，麥宜準，郭仁芬，王 光

(1.三亞市人民醫院，海南 三亞 572000；2.海南醫學院，海口 570102)

脊髓損傷是一種嚴重的創傷性神經系統疾病，嚴重影響患者的生活質量。近年來脊髓損傷的發病率呈現高發趨勢，并具有高致殘、高致死的臨床特征。臨床將其分為原發性脊髓損傷和繼發性脊髓損傷；原發性脊髓損傷則主要是由于瞬間外力或局部出血導致的不可逆神經細胞直接受損。而繼發性脊髓損傷則是由于原發性脊髓損傷后因各種原因引起的持續性病理損傷，其中炎癥、氧化應激和神經元凋亡等均參與了繼發性脊髓損傷過程[1-4]。脊髓組織發生損傷后，導致脊髓內神經傳導信號通路受損，進而誘發神經元持續凋亡、壞死；且受損組織處星形膠質細胞過度活化、增生，最終形成膠質瘢痕[5-6]。因此，神經保護類藥物在脊髓損傷的臨床治療及恢復也已成為該領域的研究重點。

他克莫司(Tacrolimus)是一種大環內酯類抗生素，具有較強的免疫抑制作用。大量文獻表明，他克莫司還具有較強的神經保護作用，其受體蛋白FKBPP(FK506 binding protein，FKBPP)在神經系統內廣泛分布。他克莫司能夠與FKBPP受體蛋白結合，進而發揮神經保護及促進神經再生作用。脊髓受損后，其脊髓組織中的神經元會加速發生凋亡；因此，阻斷和延緩神經細胞的凋亡對于脊髓損傷后的恢復具有重要意義[7-8]。

因此，本研究旨在通過觀察給予他克莫司后脊髓損傷大鼠的恢復狀況，并探究其對NF-κB/JNK通路的調節作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

45只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體重為220～240 g，購于廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2017-002]，實驗在海南醫學院[SYXK(瓊)2017-0025]進行，研究方案經海南醫學院委員會機構動物倫理委員會批準(IACUC 20170524005)。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

他克莫司購買自Astellas Ireland公司(日本)；TRIzol試劑RNA提取試劑盒(批號∶14105)購買自Invitrogen公司(卡爾斯巴德，美國)；PCR擴增試劑盒(批號∶AK9906)購買自TaKaRa公司(日本)；NFκB(批號∶1416173)和JNK(批號∶J4750)相關抗體均購買自Sigma公司(美國)；IL-4(批號∶H005)和TGF-β(批號∶H034)試劑盒購買自南京建成生物科技有限公司(中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SCI大鼠模型的建立

大鼠在適應兩周后，將所有實驗用大鼠隨機分為三組(n＝15):假手術組(Sham)，模型組(SCI)，他克莫司給藥組(SCI+0.3 g/kg)。采用Allen’s法建立T10脊髓損傷動物模型[9-10]。首先將實驗大鼠麻醉后，用10 g的鐵錘由4 cm，打擊強度為4.0 cm×10 g，損傷直徑約為3.0 mm。打擊后，可見大鼠雙后肢及尾部均可發生不同程度抽搐，提示脊髓損傷模型制備成功。假手術組則給予相同手術處理，但是不進行脊髓損傷。術后若大鼠無異常情況，則縫合傷口；并每天腹腔注射給予實驗大鼠青霉素8×104U，連續3 d以預防術后感染。造模后每天給予實驗大鼠一次他克莫司0.3 mg/kg，連續給21 d。

1.3.2 各組實驗大鼠的BBB評分

按照Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分方法對大鼠后肢運動功能進行測試[9-10]。分別在第0、1、7、14、21天進行測試。BBB評分將大鼠后肢運動功能分為0～21分，共有22個等級。0分表明后肢無運動能力，21分表明后肢運動功能完全正常。

1.3.3 組織及形態學觀察

采用HE染色對神經元形態的變化進行觀察。手術21 d后將大鼠麻醉，采用4%多聚甲醛對大鼠進行灌注；切取包括手術區域在內的脊髓組織，并在4%的多聚甲醛中浸泡24 h。然后進行脫水、包埋、切片，厚度約為5μm。進行HE染色，封片后，在顯微鏡下觀察脊髓組織的病理形態學變化。

1.3.4 RT-PCR分析脊髓組織中IL-4和TGF-β mRNA的表達水平

將收集的脊髓組織在液氮中進行勻漿，并加入1 mL裂解液，采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取總RNA，并測定相應RNA的濃度。將提取的總RNA(2μL)加入逆轉錄反應體系混合(共10μL)以合成cDNA。然后按照試劑盒說明書的具體指示測定IL-4和TGF-βmRNA的表達。

1.3.5 脊髓損傷后氧化應激相關指標的測定

行為學時間結束后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉后，將各組大鼠處死后，收集以損傷取為中心的長約1 cm的脊髓，以冰冷的生理鹽水沖洗血液后用于后續實驗分析。各指標均采用相應試劑盒進行測定，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3.6 Western blot分析

將收集的脊髓組織在液氮中進行勻漿，加入一定量的蛋白裂解液，置于冰上，以200 r/min的速度搖床晃動30 min；然后渦旋10 s，以12000 r/min離心15 min后取上清，并采用BCA法測定蛋白濃度。然后加入相應體積的loading buffer，沸水浴中變性10 min。分別進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后將蛋白轉移至PVDF膜上；用5%的胎牛血清(BSA)封閉2 h后加入一抗，平緩搖動于雜交袋，4℃過夜；TBST洗滌3次后加入熒光二抗，平緩搖動于雜交袋內2 h；棄去液體，TBST洗滌3次。凝膠成像系統成像，采用圖像分析軟件系統分析目的蛋白的相對灰度值。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 22.0軟件進行數據的統計分析，數據均以平均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行組件分析；BBB評分則采用重復測量方差分析。以P＜0.05認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 各組實驗大鼠脊髓損傷后的運動恢復情況

術前所有實驗大鼠均經過BBB評分測試，所有實驗大鼠術前的BBB評分均為21分，表明實驗大鼠運動能力均正常，無任何運動障礙。其術后的BBB評分結果如表1所示，造模1 d后，假手術組與模型組相比BBB評分出現顯著性差異(P＜0.01)，表明脊髓損傷模型建立成功；當連續給予他克莫司3 d后，其脊髓功能逐漸恢復，各組差異逐漸加大；當連續給藥21 d后，其BBB評分明顯升高(P＜0.05)，表明他克莫司對于大鼠脊髓損傷均有一定的改善作用。

2.2 各組實驗大鼠的脊髓組織病理學觀察

HE染色結果顯示，假手術組大鼠脊髓組織結構完整，纖維走向平行一致，與周圍組織結構清晰，且無出血現象和瘢痕組織生成。而模型組大鼠脊髓組織內部出血，結構排列紊亂，且組織纖維錯亂，脊髓空洞形成，脊髓組織出現明顯受損。當給予他克莫司后，其脊髓組織損傷明顯減小，脊髓神經元明顯增加，神經纖維排列整體，脊髓灰質白質界線較為清晰，空洞明顯減少，見圖1。

表1 術后各組實驗大鼠在造模后不同時間的BBB評分結果(±s)Table 1 BBB scores of rats in each group on different days after operation

表1 術后各組實驗大鼠在造模后不同時間的BBB評分結果(±s)Table 1 BBB scores of rats in each group on different days after operation

注:與Sham組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與SCI組相比，＃P＜0.05。Note.Compared with Sham group，*P＜0.05，**P＜0.01.Compared with SCI group，＃P＜0.05.

組別Groups第1天1 d第3天3 d第7天7 d第14天14 d第21天21 d假手術組Sham 18.63±2.31 19.73±1.15 19.48±1.24 20.03±1.06 19.78±0.96模型組SCI 2.43±1.97** 3.72±1.32** 7.58±1.65** 9.64±1.42* 10.36±1.05*給藥組SCI+0.3 mg/kg 2.25±1.45 5.21±1.97 9.84±1.26 13.27±0.79 18.31±0.84＃

2.3 各組實驗大鼠脊髓組織中IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的表達水平

術后21 d后，采用RT-PCR對各組實驗大鼠脊髓組織中的IL-4 mRNA和TGF-βmRNA表達水平進行測定。實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組中IL-4 mRNA和TGF-βmRNA表達量均顯著性升高(P＜0.05)；當連續給予他克莫司(0.3 mg/kg)后，其IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的蛋白表達量顯著性降低(P＜0.05)，表明他克莫司能夠顯著性抑制IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的表達，見圖2。

2.4 各組實驗大鼠脊髓組織氧化應激相關指標的變化

實驗結果顯示，模型組組中CAT(圖3A)、SOD(圖3B)、GSH-Px(圖3C)活性均較與假手術組顯著性降低(P＜0.05)，MDA(圖3D)含量顯著性升高(P＜0.05)，表明模型組大鼠機體發生氧化損傷，當給予他克莫司后，機體中CAT、SOD、GSH-Px活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低(P＜0.05)，表明他克莫司對脊髓損傷導致的實驗大鼠氧化應激損傷具有一定的保護作用，見圖3。

2.5 他克莫司對脊髓損傷大鼠脊髓組織中NFκB/JNK信號通路的調節作用

與假手術組相比，模型組中NF-κB p-p65/NFκB p-p65(圖4A、4B)和p-JNK/JNK(圖4A、4C)的表達量比值顯著性升高；當給予他克莫司后，其NFκB p-p65/NF-κB p-p65和p-JNK/JNK表達量比值顯著性降低；這表明他克莫司對于NF-κB/JNK信號通路具有明顯的調節作用，見圖4。

3 討論

脊髓損傷在臨床診治過程中非常常見，但是其病理機制較為復雜。有研究表明脊髓損傷后誘發的神經毒性反應會加重神經元的丟失，進而導致神經功能障礙。機體的過炎癥反應對神經元的丟失起著至關重要的作用[11-13]。正常情況下，脊髓受損后一定程度的炎癥反應，能夠加速受損組織修復，對于機體組織有著一定的保護作用。當機體處于過炎癥狀態時，則會加速神經元丟失。因此，有效的抑制脊髓損傷機體組織的過炎癥反應，對于神經功能的保護及恢復起著重要作用。他克莫司作為一種免疫抑制類藥物，具有減少神經細胞凋亡、促進神經細胞及組織再生的功能，能夠作用于中樞神經系統類疾病，發揮神經保護作用。他克莫司必須與其受體蛋白相結合才能發揮作用，研究表明他克莫司的受體蛋白廣泛存在于免疫系統和神經系統。與其他神經營養因子類藥物相比較，他克莫司口服后即可起效，且更加容易通過血腦屏障；因此，他克莫司在神經保護相關領域研究中得到了廣泛的關注[14-15]。

注:與Sham組相比，**P＜0.01；與SCI組相比，＃＃P＜0.01。圖2 各組實驗大鼠脊髓組織中IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的表達水平Note.Compared with Sham group，**P＜0.01.Compared with SCI group，＃＃P＜0.01.Figure 2 The expression levels of IL-4 mRNA and TGF-βmRNA in spinal cord tissue of rats in each group

注:與Sham組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與SCI組相比，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。圖4 各組脊髓損傷大鼠脊髓組織中NF-κB p-p65、NF-κB p-p65、p-JNK和JNK的蛋白表達量變化Note.Compared with Sham group，*P＜0.05，**P＜0.01.Compared with SCI group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01.Figure 4 Changes of protein expressions of NF-κB p-p65，NF-κB p-p65，p-JNK and JNK in spinal cord tissues of rats with spinal cord injury in each group

脊髓組織由于富含各種脂質類成分，因此對于氧化反應較為敏感。在正常的生理狀態下，機體組織產生的超氧陰離子、過氧化氫等產物均可被SOD、CAT等抗氧化酶所清除，機體的氧化與抗氧化體系處于一種動態平衡過程，因此不會對于脊髓組織產生病理性損傷。然而，當機體受損后，機體的自我保護機制會使得機體處于過氧化狀態，進而導致氧化應激損傷[16-18]。本實驗結果顯示，脊髓損傷大鼠機體處于氧化應激損傷狀態，而他克莫司對于這種氧化應激導致的損傷具有一定的保護作用。

氧化應激損傷能夠誘發或加重機體的炎癥反應。有研究表明，機體組織受損后，會導致各種免疫相關細胞浸潤在損傷處，并分泌各種炎癥因子和促炎因子，例如IL-4、TGF-β等，促進機體組織的自我修復。而過度的IL-4、TGF-β分泌，則會導致硬膜外瘢痕的形成。而NF-κB信號通路的抑制，則能夠顯著性降低IL-4和TGF-β的表達。JNK信號通路則是參與機體應激反應的重要信號通路，對于神經元細胞的凋亡和再生起著中重要作用[19-22]。因此，本研究測定了IL-4和TGF-β的表達水平，以及NFκB/JNK信號通路相關蛋白，結果顯示機體處于過炎癥反應，而他克莫司對于脊髓損傷誘發的炎癥反應具有一定的抑制作用。然而，他克莫司在臨床應用中部分會發生劑量依賴性的輕、中度神經毒性作用，并且其神經毒性的發生機制仍不清楚。這極大的限制了他克莫司的臨床使用。因此，他克莫司的相關衍生物的研制就顯得極為重要。

綜上所述，本研究結果表明他克莫司對大鼠脊髓損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能是通過抑制NF-KN/JNK信號通路，降低脊髓損傷組織的炎癥因子釋放，進而減輕機體炎性反應、氧化應激損傷，發揮神經保護作用。但是由于本實驗樣本及其數量的局限性，其在臨床的推廣及應用仍需要進一步的研究。